Меню

Серологические методы при ботулизме

Микробиологическая диагностика ботулизма

Возбудитель – Clostridium botulinum входит в семейство Bacillaceae, род Clostridium.

Материалом для микробиологического исследования являются рвотные массы, промывные воды желудка, кал, кровь, моча, остатки пищевых продуктов. При летальном исходе исследуют содержимое желудка, кишечника, лимфатические узлы, головной и спинной мозг.

Используют методы микробиологической диагностики: бактериологический, биологический (для выявления ботулотоксина в исследуемом материале).

С целью выявления ботулотоксина можно использовать также РОПГА с антительным диагностикумом (эритроциты, сенсибилизированные антитоксинами соответствующих типов) и определение активности фагоцитов (ботулинический токсин способен подавлять активность фагоцитов, которая восстанавливается в присутствии соответствующей антитоксической сыворотки).

Бактериологический метод. Исследуемый материал растирают в стерильной ступке с физиологическим раствором хлорида натрия.

Посев материала выполняют на специальные питательные среды, например, среду Китта-Тароцци.

Одну пробу засевают в 4 пробирки, две из которых прогревают при температуре 60°С 15 мин. (для селекции C. botulinum типа Е), а остальные – при температуре 80°С 20 мин. Накопление культур клостридий типа Е и F происходит при температуре 28°С, типа А, В, С – при 35°С в течение 48 часов.

Через 24-48 часов выдержки посевов в термостате отмечают характер роста на среде Китта-Тароцци: помутнение, газообразование. Готовят мазки, окрашивают по Граму. В случае выявления типичных клостридий с терминально расположенными спорами овальной формы в виде «теннисной ракетки» делают пересев на кровяной сахарный агар для получения отдельных колоний и выделения чистой культуры.

Для идентификации чистой культуры возбудителя определяют сахаролитические и протеолитические свойства. Антигенные свойства изучают в реакции агглютинации с типовыми сыворотками. Одновременно с изучением ферментативных свойств возбудителя выявляют ботулотоксин в фильтрате бульонной культуры и определяют его тип в реакции нейтрализации.

Биологический метод. Выявление ботулотоксина и определение его типа с помощью реакции нейтрализации имеет важное значение для назначения специфической терапии.

Для проведения реакции нейтрализации используют сухие диагностические антитоксические сыворотки типов А, В, С, Е, F, которые разводят физиологическим раствором до 100-200 МЕ / мл, что обеспечивает нейтрализацию гомологичного токсина в исследуемой пробе.

Реакцию нейтрализации проводят либо со смесью сывороток (предварительная реакция), либо с моновалентными сыворотками для определения типа токсина.

Сахаролитические и протеолитические свойства Clostridium botulinum типов А, В, С, D, Е, F

КГ – образование кислоты и газа

(КГ) – кислота и газ не у всех штаммов

+ – разжижение или пептонизация, положительная реакция

Подготовленный для исследования материал (в виде фильтрата, центрифугата или крови) разливают по 1 мл в 6 пробирок. В первые пять пробирок добавляют по 1 мл противоботулинической сыворотки типов А, В, С, Е, F соответственно, а в последнюю – 1 мл нормальной сыворотки. Пробирки инкубируют в термостате в течение 30 мин. Через 30 мин. шести парам белых мышей вводят по 1 мл смеси из каждой пробирки (кровь – внутрибрюшинно, а другие материалы – подкожно). Заболевание характеризуется появлением учащенного дыхания, расслаблением мышц брюшной стенки («осиная талия»), судорогами, параличом, смертью животного. Мыши, которым был введен центрифугат с противоботулинической сывороткой, остаются живыми.

Если в исследуемом материале есть ботулинический токсин, выживает только одна пара мышей, у которых произошла нейтрализация ботулинического токсина антитоксической сывороткой соответствующего типа.

Определение фагоцитарного показателя. Ботулинический токсин подавляет фагоцитарную активность лейкоцитов. Это свойство используют для выявления его в крови больных и в пищевых продуктах. Исследования проводят следующим образом: кровь больного смешивают в пробирке с 3% раствором цитрата натрия в соотношении 2:1. Опыт выполняют в двух пробирках с использованием поливалентной противоботулинической сыворотки. Если используют типовые сыворотки А, В, С, Е, F, соответственно, количество пробирок для исследования увеличивается. После смешивания взятых ингредиентов, пробирки помещают в термостат на 30 минут для нейтрализации токсина. В пробирки вносят по одному объему 2 млрд. суспензии Staphylococcus aureus и снова помещают в термостат на 20 минут для завершения фагоцитоза. После этого из содержимого каждой пробирки готовят мазок, фиксируют, окрашивают азурэозином и определяют фагоцитарный показатель (фагоцитарный показатель – количество стафилококков, поглощенных в среднем одним лейкоцитом. Для его определения подсчитывают микроорганизмы в 50 лейкоцитах и полученное число делят на 50.

Если в крови больного содержится ботулинический токсин, фагоцитарный показатель крови будет низким, за исключением фагоцитарного показателя той порции, в которой тип токсина соответствует типу добавленной в нее сыворотки, то есть произойдет реакция нейтрализации токсина соответствующими антителами, и фагоцитарный показатель будет значительно выше.

РОПГА с антительным эритроцитарным диагностикумом.

Сущность реакции заключается в том, что эритроциты сенсибилизируются специфическими антителами, и гемагглютинация происходит при наличии в исследуемом материале антигена. Ее высокая чувствительность и специфичность позволяет найти в исследуемом материале микро количество токсинов. Диагностический титр 1:10.

источник

Лабораторная диагностика ботулизма

Ботулизм – острая пищевая интоксикация, протекающая с преимущественным поражением центральной и вегетативной нерв­ной системы ботулиническим токсином – силь­нейшим биологическим ядом, вырабатываемым палочкой ботулизма (Clostridium botulinum)и относящемся к особо опасным патогенным биологи­ческим агентам. Ботулизм может быть связан также с вегетацией возбудителя в ране или кишечнике.

Материалом для исследования являются кровь, моча, испражнения, промывные воды желудка, остатки пищи (мясные, рыбные, фруктовые, овощные, грибные консервы, колбасы и др.). Обычно у больного с подозрением на ботулизм исследуют на наличие токсина кровь, а на наличие возбудителя – испражнения.

Биопроба.Проводится реакция нейтрализации на белых мышах с целью обнаружения ботулотоксина в исследуемом материале. Обнаружение токсина палочки ботулизма и его типа имеет важное значение для назначения пациенту антитоксической противоботулинистической сыворотки – един­ственного эффективного средства специфической терапии и экстренной профи­лактики ботулизма. Реакцию ставят со смесью антитоксических противоботулинистических сывороток, а также с моновалентными сыворотками типов А, В, Е. При наличии в исследуемом материале ботулотоксинамыши контрольной группы погибают с явлениями параличей (парез конечностей, осиная талия и т.д.). При нейтрализации токсина антитоксической сывороткой мыши остаются живыми.

Экспресс-диагностика ботулизмапроводится с помощью РНГА с антительными эритроцитарными диагностикумами для обнаружения ботулотоксина в исследуемом материале.

Бактериологический метод.Исследуемый материал засе­вают в 4 флакона со средой Китта –Тароцци; один флакон прогре­вают при температуре 60 0 С в течение 15 мин (для селекции С. botulinum типа Е), другой – при 80 0 С в течение 20 мин. Накопление куль­тур клостридий ботулизма типов Е и F происходит при 28 °С, а клостридий типа А и В при 35 °С в течение 48 ч. Для активации токсина Е к питательной среде добавляют трипсин.

Через 24 — 48 ч инкубирования учитывают характер роста посевов (помутнение и газообразование), готовят мазки в окраске по Граму. При наличии типичных бактерий в виде «теннисных ракеток» со спорами (рис.15) делают пересев на кровяной сахарный МПА, на котором С. botulinumобразует колонии неправильной формы с гладкой или шероховатой поверхностью и зоной гемолиза. В глубине столбика сахарного МПА колонии палочки ботулизма имеют вид пушинок или чечевичек.

Рис. 15. Палочка ботулизма – Clostridium botulinum. Окраска по Граму. Грамположительные спорообразующие палочки в виде «теннисной» ракетки. х900

Идентификация чистой культуры проводится на основании изучения биохимических свойств (посев в сре­ды «пестрого» ряда), изучают другие дифференциальные призна­ки (см. табл.). Антигенные свойства культуры изучают с помощью РА с типовыми сыворотками. Выявля­ют также ботулинический токсин в фильтрате бульонной культуры и его тип с помощью реакции нейтрализации на белых мышах.

Не нашли то, что искали? Воспользуйтесь поиском:

Лучшие изречения: Как то на паре, один преподаватель сказал, когда лекция заканчивалась – это был конец пары: “Что-то тут концом пахнет”. 8735 – | 8277 – или читать все.

источник

Как распознать ботулизм

Ботулизм развивается из-за попадания в организм ботулотоксина, который относится к одному из наиболее ядовитых биологических веществ. Выделяется токсин в процессе жизнедеятельности спорообразующей палочки, размножающейся в безвоздушной среде.

Попадает инфекция в организм человека при употреблении консервов домашнего приготовления, поскольку яд длительное время существует в рассолах, консервах и пищевых продуктах, содержащих различные специи. Пищевая токсикоинфекция поражает нервную систему, что может привести к остановке дыхания или сердцебиения, поэтому каждый, кто любит домашние консервы, должен знать, как определить ботулизм.

Что позволяет заподозрить развитие ботулизма

Диагностика ботулизма начинается с изучения эпидемиологического анамнеза и клинической картины заболевания. Инфекция передается фекально-оральным путем, то есть вместе с продуктами питания, недостаточно отчищенными от почвы. В подавляющем большинстве случаев, причиной болезни выступает употребление приготовленных в домашних условиях консервированных продуктов, которые были загрязнены спорами клостридий.

Токсин может находиться в банках с огурцами, помидорами, грибами и любыми другими продуктами, содержащими рассол. Необходимым условием для размножения бактерии является отсутствие кислорода, поэтому они накапливаются только в плотно закрытых банках. Если заболевший ел в течение последних 10 дней консервированные овощи, грибы, мясные изделия или соленую рыбу, то есть вероятность, что он заразился токсикоинфекцией.

Люди высоковосприимчивы к ботулотоксину, а значит, даже небольшие его дозы способны приводить к появлению клинических симптомов. Затрудняет диагностику ботулизма то, что не все, кто ел продукты из банки, заражаются, поскольку токсин концентрируется в определенном месте и достаточно минимального количества, чтобы развилась патология.

Вместе с тем часто бывают случаи семейного поражения ботулизмом после употребления долго хранившихся консервированных продуктов. В редких случаях заражение ботулотоксином происходит при контакте обсемененной жидкости с ранами и гнойниками, развивается так называемый раневый ботулизм. Поэтому нельзя даже открывать подозрительную банку с консервами.

Симптомы ботулизма

Токсин в начале заболевания может спровоцировать развитие гастроэнтерологического, глазного синдрома или острую дыхательную недостаточность. Чаще всего развивается гастроэнтерологический вариант, который протекает, как пищевая токсикоинфекция. Больной ощущает боль в верхней части живота, появляется тошнота, рвота, диарея, кожа быстро становится сухой из-за потери жидкости, нередко заболевшие говорят о том, что стало больно глотать.

В продромальный период ботулизма, протекающего по глазному варианту, больные жалуются на нарушение зрения (появление черных точек, затуманивание, утрата четкости и остроты зрения, развитие острой дальнозоркости). Даже на начальном этапе болезни может возникнуть острая дыхательная недостаточность, которая способна приводить к летальному исходу в течение 3–4 часов, поэтому если внезапно появилась и увеличивается отдышка, кожа и слизистая оболочка становятся синюшными, то срочно необходима медицинская помощь.

В разгар болезни появляются специфические для ботулизма симптомы: парезы и параличи мышц различных групп. У больных возникает офтальмоплегия (паралич мышц глаз), что может проявляться расширением зрачков, косоглазием, вертикальным нистагмом, опущением века.

Из-за пареза мышц глотки развивается дисфагия (нарушение глотания), что приводит к невозможности проглатывания пищи и жидкости. Ботулотоксин провоцирует и ослабление иннервации мимических мышц, что проявляется в асимметрии лица. Походка больных неустойчива, отмечается общая слабость. Парез мышц кишечника приводит к развитию запора.

Последовательно нарушается речь. Сначала у больного изменяется голос из-за сухости слизистой голосовых связок. Когда развивается парез мышц языка, человек не может внятно говорить. По мере прогрессирования болезни возникает парез мышц небной занавески, что делает голос гнусавым, а когда ослабевают голосовые связки, голос исчезает вовсе.

Таким образом, заподозрить развитие ботулизма можно, если больной недавно употреблял консервированные продукты, а симптомы указывают на нарушение иннервации различных групп мышц (глазных, лицевых, голосовых). При подозрении на ботулизм необходимо срочно обратиться к врачу. Специалисты проведут дифференциальную диагностику, а с помощью микробиологии будет подтверждено или опровергнуто присутствие яда в организме.

Как подтверждается диагноз

Дифференциальная диагностика проводится на начальном этапе заболевания, когда клиническая картина еще не включает специфические симптомы ботулизма. Первые признаки болезни, такие как понос, рвота, тошнота, слабость характерны для многих кишечных инфекционных заболеваний и пищевых отравлений.

Паралич глазных мышц может возникнуть в результате новообразования, отравления свинцом, алкоголем, барбитуратами, поражения головного мозга (ЧМТ, инсульт, энцефалит), заражения столбняком, дифтерией и прочими инфекционными болезнями. Дыхательная недостаточность развивается при заболеваниях бронхолегочной системы и поражениях ЦНС.

Диф. диагностика ботулизма требует исключение:

  • миастении;
  • вирусного энцефалита;
  • дерматомиозита;
  • синдрома Гийена-Баре;
  • синдрома Вернике;
  • полиомиелита;
  • отравления грибами или атропином.

Лабораторные методы

Специфическая лабораторная диагностика ботулизма на начальной стадии болезни не разработана, поэтому дифдиагностика основывается на данных эпидемиологического анамнеза (употреблении консервированных продуктов, алкоголя, получения черепно-мозговой травмы).

По мере развития ботулизма появляются характерные симптомы, которые и помогают дифференцировать болезнь (сохранность сознания и чувствительности, отсутствие жара и лихорадки, мышечные параличи). Дальнейшая диагностика проводится для определения типа токсина (А, В, С, Е, F) и подтверждения диагноза. При подозрении на ботулизм у больного берут анализ крови и мочи, и хотя исследования не являются специфичными, но они помогают установить тяжесть течения болезни.

Микробиологическая диагностика ботулизма позволяет обнаружить токсин в рвотных массах, кале, крови, моче, промывных водах желудка, остатках продуктов. Для определения вида яда используют бактериологический и биологический метод, а также устанавливают фагоцитарный показатель.

При использовании бактериологического метода взятый материал смешивают в стерильной емкости с физиологическим раствором хлорида натрия. Затем высевают материал на питательную среду в четыре пробирки. Два образца нагревают при температуре 60 ⁰С в течение 15 минут, что позволит обнаружить бактерию типа Е.

А остальные две пробирки нагревают 20 минут при 80 ⁰С. Размножаются бактерии типа Е и F при 28 ⁰С, а типа А, В, С при 35 ⁰С за 48 часов. Через 1–2 суток оценивают характер роста и проводят окрашивание мазков по Граму. После выделения чистой культуры изучают ее антигенные свойства с помощью реакции агглютинации с типовыми сыворотками.

Биологический метод предполагает определение типа токсина с помощью реакции нейтрализации, что важно для специфического лечения. Для обнаружения реакции нейтрализации применяют сухие диагностические антитоксические сыворотки, которые смешивают с физиологическим раствором. Если сыворотка действует, то в исследуемой пробе токсин нейтрализуется.

Материал для исследования помещают в 6 пробирок, в пять из них добавляют противоботулинические сыворотки типа А, В, С, Е, F, а в шестую нормальную сыворотку. Пробирки опускают в термостат на 30 минут, а затем вводят по 1 мл жидкости белым мышам. Грызуны, которым была введена подходящая противоботулиническая сыворотка, не погибают.

Ботулинический токсин снижает фагоцитарную активность лейкоцитов. Для выявления данного свойства кровь предполагаемого больного смешивают с цитратом натрия, в пробирки добавляют поливалентную или типовую сыворотку и помещают в термостат на полчаса, для уничтожения токсина. Затем в исследуемый материал вводит стафилококк и опять опускают в термостат на 20 минут для окончания фагоцитоза.

Делают мазок из каждого образца и подсчитывают количество стафилококков, захваченных в среднем одним лейкоцитом. Если в крови присутствовал ботулинический токсин, то фагоцитарный показатель низкий. Если же добавлялась типовая сыворотка в пробирки, то там, где сыворотка соответствовала токсину, произойдет нейтрализация и фагоцитарный показатель будет существенно выше.

В разгар заболевания можно обнаружить токсин в крови с помощью РОПГА с антительным эритроцитарным диагносикумом. Дело в том, что эритроциты сенсибилизируются специфическими антителами и склеивание происходит, если в образце материала присутствуют антигены. Тест позволяет обнаружить даже минимальное количество токсина в исследуемом материале, поскольку обладает высокой чувствительностью и специфичностью.

В кровь, взятую из вены, добавляют антитела, которые помечены ферментами. На них реагируют бактериальные антигены и образуют с ними иммунные комплексы, что вызывает изменение цвета материала. Специалисты по интенсивности окраски делают вывод о присутствии в образце специфических антител к ботулистическому токсину.

Метод дот-иммуноанализа позволяет распознать ботулизм уже через три часа после получения для исследования материала. С помощью теста можно проверить на токсины не только кровь, но и продукты питания, которые предположительно стали источником инфекции.

На нитроцеллюлозный мембранный фильтр, на котором находятся меченные противоботулиническе антитела, наносится исследуемый материал. После этого, фильтр обрабатывают специальным составом, который темнеет, если в жидкостях присутствует токсин. Концентрация яда определяется при сравнении с контрольной школой.

Лабораторная диагностика ботулизма подтвердит или опровергнет заболевание, что необходимо для назначения адекватного лечения, которое заключается в приеме противоботулинической сыворотки. На сегодняшний день не составляет труда определить присутствие в крови ботулотоксина, но заболевание развивается стремительно, поэтому необходимо знать, как распознать болезнь, чтобы вовремя обратиться к врачу.

источник

XII Международная студенческая научная конференция Студенческий научный форум – 2020

ЛАБОРАТОРНАЯ ДИАГНОСТИКА БОТУЛИЗМА (обзор литературы)

В преддверие зимнего сезона ботулизм являться актуальной проблемой, по причинам закупки зерна и кормов сторонних производителей, которые могут не качественно выполнять свои обязательства в технологии хранения и переработки зерна.

Ботулизм (от лат. Botulus колбаса) – тяжёлое токсикоинфекционное заболевание, характеризующееся поражением нервной системы, преимущественно продолговатого и спинного мозга, протекающее с преобладанием офтальмоплегического и бульбарного синдромов. Развивается в результате попадания в организм пищевых продуктов, воды или аэрозолей, содержащих ботулотоксин, продуцируемый спорообразующей палочкой Clostridium botulinum [1]. Несмотря на то, что ботулизм регистрируется гораздо реже, чем другие кишечные инфекции и отравления, он продолжает оставаться актуальным и опасным для жизни заболеванием. Не выраженные клинические признаки и большая схожесть других заболеваний не всегда дает точную диагностику данного заболевания.

Возбудитель относится к 18 группе по Берджи грамположительные спорообразующие палочки размерами (0,6—1,0) х (4—9) мкм относящийся к анаэробам, род — Clostridium, семейство — Bacillaceae , возбудитель — Clostridium botulinum.

Из-за спор возбудитель имеет форму теннисной ракетки (чем характерно отличается от других клостридий). Не образуют капсулы, подвижны, перитрихи, облигатные анаэробы, располагающиеся беспорядочными скоплениями или небольшими цепочками. Известно 7 типов возбудителя (сероваров) — А, В, С (подтипы С1 и С2), D, Е, F и G[1].

Несмотря на широкое распространение в природе, возбудитель почти не способен вырабатывать токсин в пищеварительном тракте животных.

При наличии соответствующих условий анаэробиоза, влажности и тепла С. botulinum размножается в органических субстратах, продуцируя токсин. Попав в организм вместе с кормом, токсин, отличающийся высокой устойчивостью к действию пищеварительных ферментов, всасывается слизистой оболочкой пищеварительного тракта, попадает в кровь и разносится по организму, вызывает расстройство деятельности коры головного мозга, центров продолговатого мозга, развитие параличей мышц глотки, языка и нижней челюсти. [2]

Токсин действует и на периферийную нервную систему. Он тормозит высвобождение медиатора ацетилхолина в синапсах периферической нервной системы, нарушая нейромышечные связи [1]. Это ведет к отключению и расслаблению мышц тела, падению мышечного тонуса, нарушению движения, параличам дыхательных мышц, сердечной мышцы, асфиксии и смерти животного.

Болезнь может протекать молниеносно, остро, подостро и хронически. Как правило, заболевание начинается остро и складывается из трех основных синдромов: паралитического, гастроэнтерального и токсического.

Характерными признаками ботулизма у всех животных являются прогрессирующая слабость, нарушение иннервации, паралич жевательного и глотательного аппарата (рисунок 1).

Рисунок 1- Паралич жевательного и глотательного аппарата

Аппетит и жажда у больных сохраняются. Животные захватывают корм, долго его пережевывают, но проглотить не могут [3]. Пытаются пить, но вода выливается из ротовой полости и через носовые ходы. Язык животного в период приступов обычно сухой и обложен желто-белым налетом. Часто из-за паралича он вываливается из ротовой полости. Животные быстро худеют [2]. Наблюдаются расстройство зрения, слюнотечение, нарушение секреторной и моторной функций желудочно-кишечного тракта.

В условия ветеринарных клиник и станций рекомендуется использовать экспресс-диагностику ботулизма с помощью РНГА (реакция непрямой гемагглютинации) с антительными эритроцитарными диагностикумами для обнаружения ботулотоксина. [1]. Принцип реакции основывается на способности эритроцитов концентрировать антиген на своей поверхности и склеиваться, образуя видимый осадок, при вступлении в контакт со специфическими антителами. Данная реакция очень информативна в диагностике разных видов ботулизма. Для этой цели проводится реакция пассивной (непрямой) гемагглютинации с сывороткой больного, в которой предполагается наличие токсина, и эритроцитами, нагруженными антителами антитоксических противоботулинических сывороток типов А, В, Е.

Контролем служит нормальная сыворотка [4]

В положительном случае эритроциты оседают на дне лунки в виде ровного слоя клеток со складчатым или зазубренным краем (зонтик), в отрицательном – оседают в виде пуговки или колечка (рисунок 2).

Рисунок 2 – Результаты РНГА при ботулизме.

Данный метод экономический выгоден, потому что он информирует и дает более точную диагностику. АИспользуемые сегодня методы диагностики ботулизма характеризуются длительностью анализа от 1 до 10 дней, что как минимум в два раза дольше инкубационного периода заболевания. Материалом для бактериологического исследования служат фекалии и рвотные массы больного, промывные воды желудка и кишечника, содержимое ран (при раневом ботулизме), подозреваемая пища [3].

Известны следующие методы диагностики токсина ботулизма [4]:

– клинические – наблюдение за зараженными возбудителем подопытными животными (белыми мышами, морскими свинками, кроликами), взятие крови, гипериммунизация;

– бактериологические – посевы Cl.botulinum на МПА с 2% глюкозой в среду Китта-Тароцци, бульон Хоттингера с 1% глюкозой, выделение чистых культур, получение и наработка бактериальной массы и продуцируемого токсина;

– культурально-морфологические и биохимические – изучение сахаролитических и протеолитических свойств штаммов Cl.botulinum;

– микроскопические – световая и люминесцентная микроскопия;

– серологические – постановка РН, РНГА, ИФА;

– радиобиологические – инактивация возбудителя Cl.Botulinum на гамма-установке “Исследователь” с источником излучения 60 Сo;

– химические – инактивация возбудителя Cl.botulinum и перевод токсинов в анатоксины с использованием 40% раствора формалина;

– диагностика с использованием микрочипов [4].

Список использованных источников.

1.Бессарабов, А. А., Е. С. Воронин и др.; Под ред. А. А. Сидорчука. / Инфекционные болезни животных – М.: КолосС, 2007.

2.Боровков, М.Ф., Фролов, В.П., Серко, С.А. Ветеринарно-санитарная экспертиза с основами технологии и стандартизации продуктов животноводства: Учебник, 2-е изд.- СПб.: «Лань», 2008

3. Гавриш В. Г. Справочник ветеринарного врача, 4 изд. Ростов-на-Дону:«Феникс», 2003.

4.Роудер, Дж. Ветеринарная токсикология / Дж. Роудер. – М.: Аквариум, 2008.

источник

Adblock
detector