Меню

Экспрессия в анализе крови

Хронический миелолейкоз. ПЦР анализ относительной экспрессии гена BCR/ABL – количественная RQ ПЦР

Молекулярно-биологическое исследование, позволяющее количественно оценить содержание в клетках белкового продукта мутантного гена BCR-ABL, который играет основную роль в развитии хронического миелолейкоза.

Количественная ПЦР в реальном времени, транскрипт химерного гена BCR-ABL.

BCR/ABL1, mRNA Detection, Reverse Transcription-PCR (RT-PCR), Quantitative, Monitoring Chronic Myeloid Leukemia (CML); Tyrosine kinase inhibitor (TKI) therapy monitoring, PCR.

Полимеразная цепная реакция в режиме реального времени.

Какой биоматериал можно использовать для исследования?

Как правильно подготовиться к исследованию?

  • Специальной подготовки не требуется.

Общая информация об исследовании

Хронический миелолейкоз является опухолевым заболеванием кроветворной системы, в результате которого в периферической крови наблюдается повышение уровня определенного вида лейкоцитов. Развитие заболевания связано с возникновением в стволовой клетке крови генетической аномалии, которая получила название филадельфийской хромосомы. У человека на девятой хромосоме локализуется ген ABL, который кодирует образование белка, стимулирующего рост и деление клеток. При хроническом миелолейкозе часть гена ABL перемещается на хромосому 22, такая мутация называется транслокацией. Место разрыва двадцать второй хромосомы, куда чаще всего встраивается перемещенная часть гена ABL, называется M-bcr (от английского major breakpoint claster region). В норме в этом участке хромосомы расположен ген BCR, кодирующий белок, функция которого в настоящее время достоверно не изучена, однако есть сведения, что он участвует в процессах деления и дифференцировки клеток. В результате транслокации на 22-й хромосоме образуется сливной, или химерный, ген BCR-ABL, при считывании информации с которого продуцируется белок молекулярной массой 210000 Да, обозначаемый р210. Иногда точка разрыва 22 хромосомы находится не в наиболее типичном месте (M-bcr), а ближе к центру хромосомы – в участке, который называется minor breakpoint claster region. Продуктом такого химерного гена является белок с уменьшенной молекулярной массой – р190. Реже точка разрыва находится на участке, расположенном дальше от центра хромосомы, при этом с мутантного гена синтезируется белок с большей молекулярной массой – р230.

От части гена ABL белок получает способности тирозинкиназы – внутриклеточного фермента, участвующего в передаче сигналов пролиферации, а часть, кодируемая геном BCR, способствует его активации. Таким образом, в результате описанной мутации на 22-й хромосоме формируется ген, белковый продукт которого – тирозинкиназа с повышенной активностью – активирует деление клеток с полной независимостью от внешних регуляторных механизмов. Лейкозные клетки становятся нечувствительными к сигналам самоуничтожения, приобретают способность выходить из костного мозга в периферическую кровь, не дожидаясь созревания. Обнаружение и количественное измерение белкового продукта химерного гена BCR-ABL используется для диагностики и оценки ответа на лечение при хроническом миелолейкозе.

Исследование проводится методом полимеразной цепной реакции. Принцип метода основан на обнаружении в исследуемом материале фрагментов ДНК химерного гена BCR-ABL, их избирательном синтезе с образованием большого числа копий. Копирование ДНК мутантного гена происходит после добавления в реакцию праймеров – последовательностей ДНК, аналогичных BCR-ABL. При этом праймеры должны быть идентичны той разновидности гена, содержание которой исследуется в образце, – для генов, кодирующих белки с разной молекулярной массой (р190, р210 и р230), нужны разные праймеры, так как их ДНК, хоть и совсем незначительно, но отличаются друг от друга. При проведении исследования в рамках первичной диагностики могут быть сделаны ПЦР на разные транскрипты гена, но в последующих измерениях целесообразно определять транскрипт, выявленный изначально, чтобы оценивать динамику его снижения. Одновременно с копированием мутантного гена производится копирование контрольного гена, исходное количество которого заведомо известно. Уровень мутантного гена рассчитывают относительно контрольного в процентах, в соответствии с международной шкалой экспрессии гена BCR-ABL (IS), или по уровню снижения в логарифмах (в 10 раз – 1 log, в 100 раз – 2 log) по сравнению с выявленным до начала лечения. При этом оценка по IS более предпочтительна.

Для чего используется исследование?

  • Для первичной диагностики хронического миелолейкоза, а также в процессе лечения ингибиторами тирозинкиназ для оценки эффективности терапии.

Когда назначается исследование?

  • При первичной диагностики хронического миелолейкоза, а после начала терапии ингибиторами тирозинкиназ – в установленные временные контрольные точки: каждые 3 месяца до того момента, как уровень относительной экспрессии BCR-ABL станет менее 1% (достижение полного цитогенетического ответа), далее в течение двух лет каждые три месяца, затем – каждые полгода.
  • При росте уровня транскрипта гена BCR-ABL на 1 логарифм (в 10 раз) после достигнутого уровня относительной экспрессии менее 0,1% (достижение большого молекулярного ответа) ПЦР должна быть повторно проведена через 1-3 месяца.

Результат выражается в процентах – уровень экспрессии мутантного гена BCR-ABL относительно контрольного гена. Уровни достигнутого ответа дифференцируются следующим образом:

0,1% и менее – большой молекулярный ответ – снижение транскрипта в 1000 раз (или на 3 логарифма) от исходного;

0,001% и менее или не определяется – полный молекулярный ответ.

  • Данное исследование имеет исключительную важность в мониторинге ответа заболевания на таргетную терапию, для максимально корректного сравнения его результатов между собой желательно проводить повторные исследования в одной и той же лаборатории.
  • При проведении повторных исследований желательно предоставлять результаты предыдущих измерений.

Клинический анализ крови: общий анализ, лейкоцитарная формула, СОЭ (с обязательной микроскопией мазка крови)

Стандартное кариотипирование клеток костного мозга

Кто назначает исследование?

Гематолог, онколог, терапевт, врач общей практики.

Wintrobe’s clinical hematology / editors, John P. Greer, Daniel A. Arber, Bertil Glader, Alan F. List, Robert T. Means Jr., Frixos Paraskevas, George M. Rodgers. – 13th edition. Lippincott Williams & Wilkins, 2014. Pages 1711-1712.

NCCN Clinical Practice Guidelines in Oncology: Chronic Myeloid Leukemia. Version 4.2018 – January 24, 2018. Available at www.nccn.org.

Гематология: национальное руководство / под ред. О. А. Рукавицына. – М. : ГЭОТАР-Медиа, 2015. С. 381-398.

источник

BCR-ABL

Что такое BCR-ABL?

BCR-ABL — гибридный белок, продукт гибридного гена BCR-ABL1, формирующегося в результатереципрокной транслокации между хромосомами 9 и 22 (филадельфийская хромосома). BCR-ABL является конститутивно активной тирозинкиназой, ответственной за онкогенную трансформацию клеток (онкобелком). Постоянная активность этой тирозинкиназы делает клетку нечувствительной к воздействию факторов роста и вызывает её избыточную пролиферацию..

Белок BCR-ABL существует в трёх формах: p190, p210 и p230, в зависимости от места прерывания BCR-фрагмента.

BCR-ABL – мишень для нескольких специально разработанных ингибиторов, которые успешно применяются для лечения хронического миелолейкоза.

Ошибочное присоединение части хромосомы 9 (ген ABL) к хромосоме 22 (ген BCR) вызывает образование мутантной хромосомы ( её называют филадельфийской, в честь города, в котором она была обнаружена). Результат этого аномального процесса – новый ген, который называется BCR-ABL.

Новый ген вызывает синтез нового белка, приводящего к формированию злокачественных клеток крови в костном мозге.

BCR – ABL провоцирует:

Хронический миелолейкоз (ХМЛ)

Данная форма лейкоза характеризуется ускоренной и нерегулируемой пролиферацией преимущественно миелоидных клеток в костном мозге с их накоплением в крови.

У абсолютного большинства людей с этим диагнозом наблюдается “филадельфийская хромосома” (BCR-ABL). К факторам риска, способствующим появлению болезни, относятся воздействие бензола и высоких доз радиации.

Большинство пациентов узнают о своей болезни случайно, после получения результатов обычного анализа крови. При данном диагнозе отмечается резкое увеличение количества молодых лейкоцитов. В случае, когда результаты анализа крови вызывают подозрение на лейкоз, пациента направляют на биопсию костного мозга.

  • Ежегодно регистрируется 1-2 заболевших на 100 тысяч населения
  • Пик заболеваемости: 30 – 50 лет
  • Госпитализация не требуется
  • Стабильное состояние на протяжении 4-5 лет
  • Не более 5% бластных клеток в костном мозге и переферической крови
  • “Легкие” симптомы: утомляемость, потливость, потеря веса, аритмия
  • 85 % пациентов к моменту постановки диагноза находятся в хронической фазе

Продолжительность хронической фазы зависит от того, насколько рано было диагностировано заболевание, а также от успешности проведённого лечения. Несвоевременное выявление болезни ведет к возникновению ускоренной стадии и острой форме лейкоза.

Лечение ХМЛ: таргетная (целевая) терапия ингибиторами тирозинкиназ: иматиниб, нилотиниб, дазатиниб и др. Данная терапия значительно улучшила показатели выживаемости.

Острый B-лимфобластный лейкоз (ОЛЛ)

Считается самым распространенным видом лейкоза у детей, но нередко встречается и у взрослых. В противоположность хроническому лейкозу развивается очень быстро. Термин «лимфобластный» означает, что незрелые клетки, составляющие основу болезни, являются лимфобластами, то есть предшественниками лимфоцитов.

Вероятность возникновения ОЛЛ несколько повышена у людей, проходивших лечение с использованием облучения или определенных видов химиотерапии.

Самые неблагоприятные прогнозы и сложное лечение болезни отмечается именно при наличии у больного мутантной филадельфийской хромосомы (BCR-ABL). Без лечения ОЛЛ приводит к гибели в течение нескольких месяцев или даже недель.

Вероятность достижения ремиссии:

Точечная мутация T315I в BCR-ABL области может вызвать резистентность пациента к назначаемым препаратам.

Следовательно, перед началом лечения следует подтвердить или опровергнуть наличие данной мутации.

источник

Экспрессия в анализе крови

Этиология и встречаемость хронического миелоидного лейкоза (ХМЛ). Хронический миелоидный лейкоз (ХМЛ) (MIM №608232) — клональная экспансия трансформированных кроветворных клеток-предшественниц, при которой возрастает число циркулирующих миелоидных клеток. Трансформация клеток-предшественниц происходит за счет экспрессии онкогена BCR-ABL.

Хронический миелоидный лейкоз (ХМЛ) составляет до 15% всех случаев лейкоза у взрослых и встречается с частотой 1-2 на 100 000; скорректированная возрастная встречаемость более высокая среди мужчин, чем среди женщин (1,3-1,7 против 1,0).

Патогенез хронического миелоидного лейкоза (ХМЛ)

Приблизительно 95% пациентов с хроническим миелоидным лейкозом (ХМЛ) имеют филадельфийскую хромосому; остальные — сложные варианты транслокаций. Протоонкоген Абельсона (ABL), кодирующий нерецепторную тирозинкиназу, находится в сегменте 9q34, а ген точечного разрыва кластерного региона (BCR), кодирующий фосфопротеин, — в 22qll.

При образовании филадельфийской хромосомы ген ABL разрывается в интроне 1, а ген BCR в одном из трех кластерных регионов разрыва; в производной хромосоме 22 фрагменты генов BCR и ABL соединяются «голова в хвост». Объединенный ген BCR-ABL в транслоцированной хромосоме 22 генерирует белок, изменяющийся по величине в зависимости от длины пептида Bcr, присоединяющегося к N-концу.

До настоящего времени функции белков Abl и Bcr в норме окончательно не определены. Белок Abl довольно хорошо сохраняется в ходе эволюции многоклеточных. Он присутствует как в ядре, так и в цитоплазме и связан с внутренней цитоплазматической мембраной. Относительное количество белка Abl в этих частях клетки изменяется в различных типах клеток, а также в ответ на стимулы.

Abl участвует в клеточном цикле, ответе на стресс, передаче сигналов от интегринов и в нервном развитии. Функциональные области Bcr включают двойную спираль для полимеризации с другими белками, область треонин-серин-киназы, область обмена ГДФ-ГТФ, вовлеченную в регуляцию белков семейства Ras, и область активации ГТФ, участвующую в регуляции Rac и Rho ГТФаз.

Экспрессия Abl не приводит к трансформации клеток, вызываемой экспрессией химерного белка Bcr-Abl. У трансгенных мышей, вырабатывающих химерный Bcr-Abl с рождения, развивается острый лейкоз, а инфицирование здоровых мышей ретровирусами, экспрессирующими Bcr-Abl, вызывает ряд острых и хронических лейкозов, в зависимости от генетического фона.

В отличие от белка Abl, химерный белок Bcr-Abl имеет активность конститутивной тирозинкиназы и ограничен цитоплазмой, где энергично связывает микрофибриллы актина. Bcr-Abl фосфорилирует несколько цитоплазматических субстратов и тем самым активизирует сигнальные каскады, управляющие ростом, дифференцировкой и, возможно, адгезией кроветворных клеток.

Неправильная активизация этого сигнального пути приводит к неуправляемому распространению гемопоэтических стволовых клеток, выходу незрелых клеток из костного мозга, и, в конце концов, к хроническому миелоидному лейкозу (ХМЛ).

По мере развития хронического миелоидного лейкоза (ХМЛ) становится все более агрессивным. В ходе этой эволюции клетки опухоли у 50-80% пациентов приобретают дополнительные хромосомные изменения [трисомию 8,i(17q), или трисомию 19], вторую филадельфийскую хромосому. Кроме описанных цитогенетических изменений, при развитии хронического миелоидного лейкоза (ХМЛ) также часто мутируют гены-супрессоры опухолевого роста и протоонкогены.

Фенотип и развитие хронического миелоидного лейкоза (ХМЛ)

Хронический миелоидный лейкоз (ХМЛ) — двух- или трехфазная болезнь. Начальный, или хронический этап характеризуется незаметно подкрадывающимся началом с постепенным развитием усталости, недомогания, потери массы тела и минимальным или умеренным увеличением селезенки. Со временем хронический миелоидный лейкоз (ХМЛ) обычно переходит в фазу акселерации и затем в бластный криз, хотя некоторые пациенты переходят непосредственно от хронической фазы в бластный криз.

Развитие хронического миелоидного лейкоза (ХМЛ) включает появление дополнительных хромосомных аномалий в клетках опухоли, прогрессирующего лейкоцитоза, анемии, тромбоцитоза или тромбоцитопении, всевозрастающую спленомегалию, лихорадку и костные нарушения. Властный криз — состояние острого лейкоза, бласты могут быть миелоидными, лимфоидными, эритроидными или недифференцированными. Фаза акселерации — промежуточная между хронической фазой и бластным кризом.

Приблизительно 85% больных диагностируют в хронической фазе. В зависимости от метода исследования, средний возраст постановки диагноза колеблется от 45 до 65 лет, хотя заболеванию подвержены лица любых возрастов. При отсутствии лечения показатель перехода из хронической фазы в бластный криз составляет приблизительно 5-10% в первые 2 года и затем 20% за год. Поскольку бластный криз быстро приводит к летальному исходу, развитие криза равнозначно смерти.

Особенности фенотипических проявлений хронического миелоидного лейкоза (ХМЛ):
• Возраст начала: от середины до конца зрелости
• Лейкоцитоз
• Спленомегалия
• Усталость и недомогание

Лечение хронического миелоидного лейкоза (ХМЛ)

Выяснение молекулярной основы хронического миелоидного лейкоза (ХМЛ) привело к разработке специфического ингибитора тирозинкиназы Bcr-Abl — иматиниба (гливек). Теперь это лекарство — основной препарат при лечении хронического миелоидного лейкоза (ХМЛ). Более 85% больных дают четкий цитогенетический ответ на терапию иматинибом, с исчезновением t(9;22) в клетках, получаемых при пункции костного мозга.

Цитогенетический ответ соответствует значительному уменьшению тяжести хронического миелоидного лейкоза (ХМЛ) до уровня ниже 10 9 -10 10 лейкемоидных клеток. Тем не менее только у некоторых пациентов (

источник

Характеристика профилей экспрессии гена цельной крови в качестве продолжения снижения мРНК глобина у пациентов с болезнью клеток серпа

Задуманные и разработанные эксперименты: NR MTG. Выполняли эксперименты: NR. Проанализированы данные: XX PM. Используемые реагенты / материалы / инструменты анализа: NR. Написал документ: NR MTG.

Было доказано, что глобальный транскриптометрический анализ РНК цельной крови с использованием микрочипов является сложным из-за высокого содержания транскриптов глобина, составляющих 70% мРНК цельной крови. Это особая проблема у пациентов с серповидно-клеточным заболеванием, вторичная по отношению к высокому содержанию глобулин-экспрессирующих зародышевых эритроцитов и ретикулоцитов в кровообращении. Для точного измерения транскриптома крови стационарного состояния у пациентов с серповидноклеточками мы оценили эффективность сокращения транскриптов глобина в стабилизированной PAXgene РНК для анализа транскриптома в геноме с использованием микрочипов. Мы демонстрируем здесь как микрочипы, так и Q-PCR, что метод истощения мРНК глобина приводил к 55-65-кратному сокращению транскриптов глобина в цельной крови, собранных у здоровых добровольцев и пациентов с заболеваниями серповидноклеточных систем. Это привело к улучшению качества данных микрочипов за счет снижения изменчивости данных с увеличением скорости обнаружения экспрессированных генов и улучшенным перекрытием с сигнатурами экспрессии изолированных мононуклеарных препаратов периферической крови (РВМС). Анализ различий между транскриптомом цельной крови и транскриптом РВМС показал важные гены эритроцитов, которые участвуют в патогенезе и компенсации серповидноклеточных клеток. Комбинация снижения мРНК глобина после стабилизации РНК цельной крови представляет собой надежную методологию клинических исследований для обнаружения биомаркеров для гематологических заболеваний.

Открытие транскрипционных биомаркеров представляет собой перспективную стратегию в области трансляционной медицины для раннего выявления заболеваний, развития персонализированной терапии сложных заболеваний и определения специфических для болезни сигнальных путей [1], [2]. В связи с этим анализ транскриптомы на основе микрочипов, по-видимому, является пограничной технологией для идентификации потенциальных биомаркеров при применении к биологическим материалам, наиболее важным для исследуемых фенотипов. К ним относятся биопсийные материалы из тонкоизмельченных аспиратов (FNA), субпопуляции клеток или обогащенные изоляты из микродиссекции лазерного захвата (LCM). Хотя профили транскрипции в таких целевых тканях / клетках-мишенях идеально подходят для таких анализов, сложность приобретения таких биопсий / клеток ткани и небольшое количество РНК из этих образцов для стандартных анализов микрочипов сделала целую кровь, практичную и привлекательную суррогатную ткань в клинических исследованиях [3], [4], [5], [6], [7]. Готовая доступность крови, неинвазивно-инвазивный метод сбора проб и критическая роль клеток крови в иммунном ответе устраняют преимущества биопсии / клеток крови для измерения состояния болезни и реакции лекарственного средства. Используя глобальный транскрипционный анализ клеток РВМС у пациентов с серповидно-клеточной анестезией, мы определили важные пути изменения болезни, включая повышение активности каталитического антиоксиданта (пероксиредоксин, глутатионпероксидазу, глутатион-S-трансферазу, тиоредоксин) и регуляторы антипролиферативного клеточного цикла (Heme oxygenase 1, Biliverdin Reductase и P21 [1].

Традиционно образцы цельной крови для экспрессии генов были собраны в пробирках CPT (Becton Dickinson) с антикоагулянтом. Тем не менее, наблюдалось, что со временем наблюдаются изменения профиля экспрессии РНК в таких фракционированных образцах [4], [8], что подразумевает необходимость стабилизации РНК между сбором и выделением проб для поддержания профиля экспрессии клеток крови. Хотя это было достигнуто путем выделения мононуклеарных клеток периферической крови сразу после сбора образцов, трудоемкие методы, связанные с этим процессом, и необходимость технических экспертов в этой области на момент сбора проб препятствовали его применению в крупномасштабных многоцентровых клинических испытаниях , Попытки преодолеть эти препятствия привели к разработке новых подходов, которые облегчили бы сбор проб и стабилизацию РНК [9]. В этом отношении система РНК PAXgene (PAX) широко используется в исследованиях экспрессии генов периферической крови. Несмотря на то, что эта система использует простой способ сбора, хранения, транспортировки и стабилизации РНК из цельной крови, многие исследования показали, что РНК, полученная из труб крови PAXgene, приводит к значительному увеличению общей изменчивости и снижению чувствительности к детектированию транскрипции с использованием микрочипов [ 6]. Наблюдаемые аномалии в значительной степени объясняются наличием преобладающих количеств транскриптов глобина, которые составляют

70% мРНК в образцах цельной крови [7]. Мы обнаружили, что это представляет собой серьезную проблему для изучения гемолитических анемий, таких как болезнь серповидноклеточных, из-за высокого содержания транскриптов глобина в зарождающихся эритроцитах и ​​ретикулоцитах. Обращаясь к этим ограничениям, мы предприняли текущее исследование оценки методов, которые сочетают стабилизацию РНК и сокращение транскриптов глобина в цельной крови, чтобы определить пригодность глобиновой восстановленной РНК для исследований транскриптома на основе микрочипов при болезни серповидноклеточных клеток. Мы демонстрируем здесь, что эффективное удаление транскриптов глобина в стабилизированной PAXgene цельной крови значительно улучшает чувствительность обнаружения транскриптов на микрочипах и улучшает идентификацию генов, которые значительно модулируются во время процесса болезни серповидноклеточных клеток. Мы также сообщаем здесь наши наблюдения о сходствах и различиях выраженных транскриптов в РВМС и обогащенной глобином и глобиновой обедненной цельной крови. С биологической точки зрения геном PAX с обедненным глобином по сравнению с профилем экспрессии разности PBMC предоставляет окно в профили экспрессии эритроцитов в реальном времени при болезни серповидноклеточных клеток.

Исследование было одобрено Национальным институтом по изучению состояния сердца и института крови, и из участников исследования были получены письменные обоснованные согласия. Пациенты, отобранные для этого исследования, включали 10 пациентов с серповидно-клеточной анемией среднего возраста 41,6 ± 10,1 и контрольной самооценкой 10 афро-американских субъектов среднего возраста 42,2 ± 8,9. Образцы пациента собирали в стационарном состоянии, и ни один из них не принимал антитромбоцитарные препараты. Профили экспрессии (контроль N = 5; SCD N = 5) сравнивали с данными дифференциальной генерации генов, полученными в ходе предварительного исследования 27 пациентов и 13 контрольных [1].

Периферическую кровь пациентов с серповидноклеточной клеткой и здоровых афро-американских добровольцев собирали в пробирку для приготовления клеток Vacutainer (CPT) с цитратом натрия и Ficoll (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ). Очищенные суспензии мононуклеарных клеток периферической крови (PBMC) ресуспендировали в буфере RLT (700-1000 мкл на 107 клеток) и пропускали через колонки Qiashredder (Qiagen, Valencia, CA), затем хранили при -70 o C. Общая РНК экстрагировалась из периферической крови мононуклеарных клеток с использованием набора RNeasy Mini Kit (Qiagen).

Образец крови (2,5 мл), собранный в пробирках PAXgene ™ от каждого испытуемого, инкубировали при комнатной температуре в течение 4 ч для стабилизации РНК и затем хранили при -80 ° С. РНК была извлечена из цельной крови с использованием набора PAXgene ™ Blood RNA System Kit в соответствии с рекомендациями производителя. Вкратце, образцы удаляли от -80 ° C и инкубировали при комнатной температуре в течение 2 часов для обеспечения полного лизиса. После лизиса пробирки центрифугировали в течение 10 мин при 5000 × g, супернатант отбрасывали и добавляли 500 мкл свободной от РНКазы воды в таблетку. Пробирку тщательно перемешивали, чтобы повторно суспендировать осадок, центрифугировали в течение 10 мин при 5000 × g и весь супернатант отбрасывали. Осадок повторно суспендировали в 360 мкл буфера BR1 путем встряхивания и дальнейшую очистку РНК проводили по протоколу производителя с расщеплением ДНК-колонны на колонке.

Качество очищенной РНК было проверено на биоанализаторе Agilent® 2100 (Agilent Technologies, Palo Alto, CA); Концентрации РНК определяли с использованием спектрофотометра NanoDrop® ND-1000 (NanoDrop Technologies, Wilmington, DE).

Глобиновая мРНК была истощена из части каждого общего образца РНК, выделенного из пробирки PAXgene, с использованием набора GLOBINclear ™ -Human (Ambion, Austin, TX). Вкратце 2 мкг общей РНК из цельной крови человека смешивали с биотинилированным Capture Oligo Mix в буфере для гибридизации. Смесь инкубировали в течение 15 минут, чтобы биотинилированные олигонуклеотиды гибридизовали с видами мРНК глобина. Затем добавляли магнитные шарики стрептавидина для захвата мРНК глобина и магнитные гранулы затем вытягивали в сторону трубки с помощью магнита, а РНК, обедненную мРНК глобина, переносили в свежую пробирку. РНК дополнительно очищали с использованием метода быстрой очистки на основе гранулометрического шарика, как было предложено изготовителем.

Мечение и гибридизацию кРНК проводили в соответствии с протоколами от Affymetrix Inc. (Santa Clara, CA). Вкратце, 1 мкг общей РНК из образцов PBMC, цельной крови (PAX) и глобина (PAX-GR) превращали в двухцепочечную кДНК с праймером T7- (dT) 24. КДНК транскрибировали in vitro с биотинилированной комплементарной РНК (кРНК) путем включения биотина-CTP и биотина-UTP с использованием набора для аметиметриса IVT. Двадцать мкг биотин-меченной РНК фрагментировали до размера

200 п.н. путем инкубации в буфере фрагментации, содержащем 200 мМ Трисацетат, рН 8,2, 500 мМ ацетата калия и 500 мМ ацетата магния в течение 35 минут при 94 ° С до гибридизации. Фрагментированную РНК оценивали по относительной длине биоанализатора Agilent 2100 и гибридизовали с микросхемой Affymetrix HG-U133 plus 2.0 в течение 16 часов, промывали, окрашивали на флюидизирующей станции Affymetrix и сканировали с использованием сканера сканера Affymetrix.

Affymetrix GCOS версия 1.4 использовалась для расчета интенсивности сигнала и процентов текущих вызовов гибридизованной микросхемы Affymetrix. Значения интенсивности сигнала, полученные для наборов зондов в микрочипах, были преобразованы с использованием адаптивного стабилизирующего дисперсию, квантилово-нормировочного преобразования, называемого «S10» (описано в Munson, PJ, GeneLogic Workshop of Low Level Analysis of Affymetrix GeneChip Data, 2001, http: //stat-www.berkeley.edu/users/terry/zarray/Affy/GL_Workshop/genelogic2001.html, программное обеспечение доступно по адресу http://abs.cit.nih.gov/geneexpression.html.). Эта трансформация S10 служит для того, чтобы сделать дисперсии равномерными вверх и вниз по шкале измерений, в то же время позволяя проводить прямые сравнения преобразованных интенсивностей между микросхемами и отображать данные в масштабе, почти соответствующем логарифму базы 10 в центральном диапазоне измерений. Преобразованные данные из всех чипов были подвергнуты анализу основных компонентов (PCA), чтобы обеспечить обнаружение выбросов. Тренировочный тест между серпом и контролем выполнялся для PBMC, PAX и PAX-глобинов соответственно, а p-значение для различий между двумя группами было рассчитано для каждого из 54 675 наборов зондов. Чтобы решить проблему множественных сравнений, для каждого набора зондов была рассчитана ложная скорость обнаружения (FDR). Фильтры FDR применялись в дополнение к обрезанию смены (FC). Двусторонняя иерархическая кластеризация использовалась для объединения наборов образцов и генов с аналогичной моделью выражения. Иерархический кластер запускается из статистического программного пакета JMP (www.jmp.com, Cary, NC) с использованием метода ward.

Чтобы сравнить эти данные с ранее опубликованными данными, которые были сгенерированы на массиве HG-U95, для сопоставления наборов зондов между двумя массивами использовались данные сравнения массива для наилучшего соответствия с массивами HG-U95 до HG-U133 плюс 2.0, загруженные с сайта Affymetrix. Анализ онтологии генов проводился с использованием DAVID Bioinformatics Resources 2007 в сети (http://david.abcc.ncifcrf.gov/)

Все данные микрочипов, указанные в этой рукописи, описаны в соответствии с рекомендациями MIAME. Данные также были представлены в ГЕО, а подача № — GSE 16728.

Первичная кДНК была синтезирована с использованием 500 нг РНК и случайных праймеров в 20 мкл реакционной смеси обратной транскриптазы с использованием набора для синтеза кДНК Superscript Invitrogen (Invitrogen, Carlsbad, CA) в соответствии с указаниями производителя. Количественные анализы ПЦР в реальном времени проводили с использованием ген-специфических двойных флуоресцентно меченых зондов в детекторе последовательностей 7900 (PE Applied Biosystems, Norwalk, CT). Зонды и праймеры были получены из Applied Biosystems. Вкратце, ПЦР-амплификацию проводили на 384-луночном планшете с 20 мкл реакционной смесью, содержащей 300 нм каждого праймера, 200 нм зонда, 200 нм dNTP в 1x реальном времени ПЦР-буфера и пассивного эталонного (ROX) флуорохрома. Условия термического циклирования составляли 2 мин при 50 ° С и 10 мин при 95 ° С, а затем 40 циклов с денатурацией 15 с при 95 ° С и 1 мин отжиге и растяжении при 60 ° С. Образцы анализировали в двух экземплярах, а КТ полученные значения были нормированы на генный β-актин. Сравнительный метод CT (ΔΔCT), который сравнивает различия в значениях CT между группами для достижения относительного изменения складки в экспрессии генов.

Исследование изолированной общей РНК из PBMC, PAX, PAX-GR в лаборатории на чип-системе показало, что они имеют высокое качество с интактной рибосомной РНК 18 и 28s с номерами RIN более 9,0, как показано на рисунке 1A. Наблюдалось снижение концентрации РНК на 20-25% в процессе глобинового истощения. 1 мкг общей РНК из PBMC, PAX и PAX-GR обрабатывали для синтеза биотинилированной кРНК для гибридизации генных чипов. Выход кРНК из этих образцов находился в диапазоне 25 ± 4,1 с приемлемым отношением 260/280, равным 1,9-2,1. При анализе с использованием биоанализатора было обнаружено, что ярко выраженный пик, соответствующий

700 нуклеотидам, представляющим собой кРНК глобина, присутствует только в образцах PAX ​​РНК. Образцы PBMC и PAX-GR демонстрировали идентичную модель смазывания кРНК-продуктов, как показано на рисунке 1B, что указывает на истощение значительных количеств глобинов в образцах PAX-GR.

A. Качество общей РНК из PBMC, PAX и PAX-GR. Интактные рибосомные полоски 18 и 28s показаны в электрофореграмме, определенной в агрегированном биоанализаторе. B. Качество биотинилированной кРНК из PBMC, PAX и PAX-GR. Преобладающий пик 700 bp представляет собой глориновую кРНК в образцах PAX. cRNA из PBMC и PAX-GR показывают аналогичную картину мазка транскриптов. 1. Красная линия — PAX. 2. Синяя линия — PAX-GR. 3. Зеленая линия — РВМС.

Чтобы подтвердить эффективность снижения мРНК глобина, образцы РНК как из образцов PAX, так и PAX-GR анализировали с помощью RT-PCR с использованием такмановских праймеров как для альфа-, так и бета-глобинов, а нормированные значения CT были рассчитаны с использованием 18-го года как ген, поддерживающий дом. Существовало значительное истощение как альфа-, так и бета-глобинов в образцах PAX-GR, как показано увеличением значений CT дельта (нормировано на 18S РНК) как для бета, так и для альфа в качестве продолжения сокращения глобина, как показано на рисунке 2A. Гамма-глобины не показали существенной разницы между образцами PAX и PAX-GR. Изучение интенсивности трансформированного сигнала S10 для альфа- и бета-глобинов в образцах PAX ​​и PAX-GR показало аналогичную картину на уровне экспрессии глобина с разностью интенсивностей сигнала> 0,3 (или примерно log10 2 раза, представляющей примерно 3 раза на S10) между PAX и PAX-GR для генов альфа и бета-глобина. (Фиг. 2В и С).

A. Экспрессия 18s, транскриптов глобина α, β с помощью RT-PCR в PAX и PAX-GR из контрольных и SCD-образцов. Значения Ct в выражении глобинов приведены как среднее ± SD для каждой группы. Красный бар — PAX-Control; Зеленая полоса — контроль PAX-GR; Желтая панель — PAX-SCD; Синяя панель — PAX-GR-SCD. B. Нормализованные интенсивности сигналов для зонда β-глобина из микрочипов для контрольных и SCD-образцов. Значения указаны как среднее ± SD. Серый бар — PAX; Черный бар — PAX-GR. C. Нормализованные интенсивности сигналов для α-глобиновых зондов из микрочипов для контрольных и SCD-образцов. Значения указаны как среднее ± SD. Серый бар — PAX; Черный бар — PAX-GR.

При гибридизации биотинилированных цРНК с HG U133 плюс 2,0 генных чипов повышенная чувствительность при обнаружении экспрессированных транскриптов наблюдалась в образцах PAX-GR, как оценивалось по числу генов, названных выше фона (настоящие вызовы), масштабному коэффициенту и интенсивности сигнала , Масштабный коэффициент, косвенная мера сигнала, с более низкими значениями, указывающими на более высокий сигнал матрицы, существенно уменьшился как от контрольных, так и от SCD-образцов после истощения глобина с 28 ± 12,0 до 11,2 ± 3,7. Это привело к увеличению среднего сигнала и большей чувствительности во всем распределении. Более высокий сигнал, особенно для слабо выраженных генов, привел к лучшим оценкам текущих вызовов. Наибольшее количество транскриптов было обнаружено в образцах PBMC, за которыми следуют PAX-GR и PAX соответственно. На рисунке 3 показано увеличение чувствительности обнаружения, о чем свидетельствует увеличение обнаруживаемых транскриптов после сокращения глобина как в контрольных, так и в SCD образцах. Истощение глобинов как из контрольных, так и для образцов SCD пациента увеличивает текущую скорость звонка на 22-25%, и это увеличение чувствительности обнаружения было более выраженным с помощью образцов SCD.

Значения указаны как среднее ± SD для количества настоящих транскриптов в каждой из групп в каждом типе выборки.

Чтобы определить, уменьшает ли снижение глобина внутриутробную изменчивость выборки, анализ графика рассеяния всех элементов массива выполнялся путем сравнения двух контрольных объектов по трем различным типам выборки. Образцы PBMC показали самую высокую корреляцию (R2 = 0,92) и самую низкую изменчивость между образцами, в то время как образцы PAX имели R2 всего 0,71. Однако при уменьшении глобина эта изменчивость была снижена, а значение R2 увеличилось до 0,89. Дальнейший анализ генов, экспрессированных генами в образцах контрольных и серповидноклеточных клеток с использованием либо препарата PAX, либо PAX-GR показал, что средняя средняя квадратическая ошибка (MSE) внутри группы (SCD или контроль) составляет 0,0063 для образцов PAX и 0,0037 для образцов PAX-GR. Это наглядно демонстрирует существенное, более 40% уменьшение дисперсии ошибок, используя метод сокращения глобина.

Сравнительный анализ выраженных транскриптов из наборов образцов для контроля и пациентов продемонстрировал сильное перекрытие генов между PAX-GR и PBMC с 11136 транскриптами, перекрывающимися с транскриптами 12088 из PBMC. Образцы PAX, с другой стороны, показали меньшее число (8954), перекрывающееся с PBMC, как показано на рисунке 4. Аналогично в образцах SCD перекрытие транскриптов между PBMC и PAX-GR было сильнее, когда 10403 набора зондов перекрывались с 12134 транскриптами в PBMCs, чем PAX с множеством зондов 8208, перекрывающимися с PBMC. Между PAX и PAX-GR перекрытие составляло 88,8% у контрольных субъектов и 94,4% у пациентов с SCD, предполагая, что процесс истощения глобина существенно не изменяет картину экспрессии цельной крови. В таблице 1 перечислены выбранные гены из этой категории неизмененных генов. GO анализ генов, которые являются общими для PAX и PAX-GR, показал им способность связывать нуклеиновую кислоту (27%), связывание с цитоскелетным белком (24,9%), связывание с транскрипционным фактором (17,9%) и активность фермента (16,9%) в виде показанный на рис. 5. Интересно, что процесс истощения глобинов маскирует 3,023 транскрипта в контрольных образцах и 5644 транскрипта из образцов SCD, о чем свидетельствует способность обнаруживать их как настоящие вызовы в образцах PAX-GR. В таблице 2 перечислены несколько отобранных генов, которые были разоблачены процессом глобинового истощения, о чем свидетельствует трансформация отсутствующего вызова к настоящему вызову, а также несколько выбранных генов, которые остаются неизменными. Незамаскированные гены, исследованные геномным онтологическим анализом, функционируют как связывающие белки и ферменты, участвующие в биологических процессах, таких как транскрипция, внутриклеточный перенос и биохимическая сигнализация. Было обнаружено, что 100 генов, представляющих гипотетические белки, кДНК-клоны, неизвестные транскрипты и гены, такие как гемохроматоз, гемоглобин epsilon 1 и транскрибированный локус, сходный с альфа-гемоглобином, которые были обнаружены только в образцах PAX, были замаскированы или потеряны процессом восстановления глобина, как указано неспособность их обнаружить в образцах PAX-GR. Анализ BLAST показал, что некоторые из этих транскриптов могут иметь сходство последовательностей с глобинами.

Многие гены имеют несколько описаний онтологий генов.

Сравнивая профили экспрессии гена полной истощенной цельной крови у пациентов с серповидно-клеточной анемией и здоровых афроамериканских добровольцев с использованием строгих статистических фильтров с 20% ложной скоростью обнаружения и сгибанием более чем 2, мы идентифицировали 909 существенно измененных транскриптов (рис. 6А) , Эти гены в значительной степени перекрываются с дифференцированным списком генов из группы образцов PAX, а изменения складки сильно коррелируют (R = 0,96), как показано на рисунке 6B, что указывает на то, что процесс истощения глобина не изменяет первоначальный ген цельной крови профиль экспрессии этих субъектов.

A — Вулкан-график сравнения SCD и контрольных образцов. Ось X представляет собой изменение смены, а ось Y представляет значение Р. B — Корреляция дифференциально экспрессируемых генов в образцах PAX ​​и PAX-GR.

Более пристальное изучение этих дифференциально регулируемых генов после фильтрации при 10% FDR и FC более 5, как показано на рисунке 7, выявило значительную регуляцию эритроцитарных специфических генов, таких как анкирин, полоса 3 и 4 мембранного белка эритроцитов, гемоглобины и гликофорин A в серповидноклеточная анемия. Другие транскрипты, которые были идентифицированы как дифференциально регулируемые при болезни серповидноклеточных клеток, включали киназу BMP2, связывающий селен белок, экспорт, сперминоксидазу, пероксиредоксин 2, хемокины, интерлейкиновый рецептор и пептидил-аргининдезаминазу, и они, как известно, являются ключевыми регуляторами в окислительно-восстановительном обмене и воспалительном процессов, как показано в таблице 3. Несколько отобранных генов из списка дифференцированных генов с изменением складки> 2 из группы PAX-GR были подтверждены с помощью RT-PCR-анализа, а результаты, подтверждающие данные микрочипов, показаны в таблице 4 ,

Кластерный анализ применялся к данным генной экспрессии, полученным из всех зондов HG-U133 plus 2.0 при FDR 10% и FC> 5,0. Уровень экспрессии каждого гена в каждом образце относительно среднего уровня экспрессии этого гена по всем образцам представлен с использованием красной, черной и зеленой цветовой гаммы (зеленый — ниже медианы, черный — равен медианному, красный — выше среднего ). Дендрограмма отображает неконтролируемую кластеризацию пациентов и контрольных субъектов с использованием дифференциально экспрессируемого списка генов.

Сравнительный анализ дифференциально регулируемых генов из трех разных типов образцов из этого исследования в наше предыдущее исследование по РВМС привел к отображению 106 из 112 наборов зондов из ранее опубликованных данных в текущие данные. Дальнейший анализ на 106 наборах зондов показал достаточно высокую корреляцию с РВМС от текущего исследования с коэффициентом корреляции 0,51 с последующим снижением PAX с коэффициентом корреляции 0,41. Плохая корреляция наблюдалась с образцами PAX с коэффициентом корреляции только 0,21. Следует иметь в виду, что эти исследования проводились в разных партиях с использованием совершенно другого набора пациентов и контрольных субъектов и двух разных типов генных чипов. Даже учитывая эти ограничения, сокращение глобина улучшает корреляцию с РВМС из нашего предыдущего исследования, предлагая преимущества истощающих глобинов в РНК цельной крови для исследований микрочипов.

Периферическая кровь является важным типом ткани для биомедицинских исследований из-за ее критической роли в иммунном ответе и метаболизме. Простота и легкость сбора также сделала периферическую кровь привлекательной суррогатной тканью для открытия биомаркеров гематологических заболеваний и широкого спектра негематологических расстройств. Таким образом, применение микрочиповой технологии на периферической крови может дать новое представление о вариациях в глобальной экспрессии генов, конкретно связанных с состояниями нормального и болезненного, и имеет потенциал применения технологии в выявлении и диагностике заболеваний.

Хотя глобальная технология экспрессии генов была успешно применена на фракционированных образцах крови [10], [11], таких как РВМС, успешные исследования профилей экспрессии генов в общей РНК цельной крови были ограничены из-за гетерогенных типов клеток и потенциальных изменений ex vivo от обработки и обработки крови. РВМС с более однородной клеточной популяцией, содержащей лимфоциты и моноциты, являются наиболее транскрипционно активными клетками в крови [5], что делает его идеальным образцом для исследования. Однако процедура дополнительного фракционирования для РВМС требует длительного периода до стабилизации РНК, и было показано, что она имеет значительные изменения ex vivo в профилировании экспрессии генов [12], [13]. Кроме того, в многоцентровых клинических испытаниях выделение РВМС во время сбора проб считалось основным недостатком, поскольку квалифицированные специалисты необходимы для обработки образцов на участке, что также может приводить к изменчивости, вызванной оператором в микроаррисах.

Однако с уникальными для всего образца крови проблемами, в том числе сложным составом гетерогенных типов клеток и более низкой чувствительностью обнаружения и более высокой изменчивостью данных, сейчас трудно применить технологию микрочипов для полной РНК цельной крови. Широко распространено мнение, что обильные транскрипты глобина в цельной крови являются причинными факторами для пониженной чувствительности и повышенной изменчивости в исследованиях экспрессии генов на основе микрочипов. Настоящее исследование представляет собой исследовательское исследование с целью разработки надлежащих методов, которые бы истощили РНК гемоглобина из цельной крови, для применения технологии микрочипов на полной фракции цельной крови на основе глобина. Мы выбрали большую систему глобинов, а именно серповидноклеточную болезнь для этого исследования, чтобы оценить процесс истощения глобина, а также обнаружить новые гены, которые связаны с серповидно-клеточным заболеванием, включая типы клеток, такие как зародышевые эритроциты, в дополнение к обычным РВМС.

Амбионный глобиновый прозрачный метод привел к 55-65-кратному истощению транскриптов глобина в цельной крови, что в конечном итоге привело к значительному улучшению качества данных микрочипов с увеличением скорости обнаружения экспрессируемых генов на 22-25%, и это увеличение было более выраженным в SCD , Это увеличение чувствительности обнаружения, по-видимому, является отражением более высокой интенсивности сигнала и более низким отношением сигнал / шум, о чем свидетельствует преобразование отсутствующего вызова в настоящий вызов, как показано в таблице. 2. Интересно, что даже после сокращения глобина образцы PAX и PAX-GR с помощью анализа основных компонентов группировались вместе, а не кластеризуются с РВМС. Более важно то, что основы сегрегации образцов, по-видимому, зависят от типов образцов, а не от биологической природы образцов, предполагающих, что PAX и PAX -GR даже после истощения глобина имеют уникальный профиль экспрессии по сравнению с PBMC, и это можно объяснить наличием клеток, отличных от мононуклеарных клеток в РНК цельной крови. Улучшение чувствительности обнаружения после истощения глобина также позволило обнаружить несколько генов, которые были замаскированы глобинами в исходных образцах ПАХ.

Предыдущие исследования влияния снижения глобина из цельной крови предполагали, что истощение глобина может привести к трансформации в исходный профиль экспрессии генов [13]. Напротив, наш сравнительный анализ по различным типам образцов, как показано на диаграмме Венна, явно продемонстрировал высокую точность в экспрессии генов с высокой степенью перекрытия (88-94%) между образцами PAX и PAX-GR. Процесс истощения глобина представляется выгодным, поскольку он уменьшает изменчивость данных между образцами, как показано диаграммой рассеяния и анализом ошибок. Что еще более важно, истощение глобинов привело к разоблачению более 3000 транскриптов в образцах цельной крови, которые показывают анализ GO, имеют биологические функции процесса, такие как транскрипция, внутриклеточный перенос и биохимическая сигнализация. Это в конечном итоге привело к улучшению степени перекрытия между PAX-GR и PBMC на 73-80%. Размывание генов процессом глобинового истощения также привело к увеличению идентификации транскриптов, которые дифференциально регулируются при болезни серповидноклеток, и эти дифференциально регулируемые гены включают эритроцитарные специфические транскрипты, такие как анкирин, белковая полоса 3 эритроцитов и группа 4, гемоглобины и гликофорин А. Транскрипты, такие как BMP2 киназа, селенсвязывающий белок, экспорт, сперминоксидаза, пероксиредоксин 2, хемокины, интерлейкиновый рецептор и пептидил-аргининдезаминаза, которые, как известно, являются ключевыми регуляторами в окислительно-восстановительном метаболизме, воспалительный процесс также продемонстрировали дифференциальное регулирование при болезни серповидноклеточных , Этот список генов со статистическими фильтрами при 20% FDR и FC> 2 значительно отличался от списка, полученного из РВМС, и это можно объяснить гетерогенной смесью клеток в цельной крови. Затем мы сравнили 112 дифференциально регулируемых генов (5% FDR и FC> 1,2) из ​​нашего предыдущего исследования по РВМС, используя больший набор пациентов и контролировали текущее исследование параметрическим анализом. Таким образом, было очевидно, что РВМС из текущего исследования в значительной степени коррелировали с предыдущим исследованием с R-значением 0,51, за которым следуют PAX-GR (R = 0,41) и PAX с величиной R всего 0,21. Хотя эти значения коэффициента корреляции не так высоки, как можно было бы ожидать от них, здесь следует помнить, что эти два исследования были выполнены с использованием совершенно другого набора пациентов и добровольцев, использующих два разных генных чипа. Тем не менее, корреляционные исследования ясно показали, что уменьшение глобина путем разоблачения нескольких сотен генов в цельной крови создает профиль экспрессии генов, который умеренно сопоставим с профилем экспрессии РВМС.

Таким образом, это исследование демонстрирует, что применение процесса восстановления глобина в цельной крови очень выгодно для создания значимых данных из микрочипов. С биологической точки зрения геном PAX, истощенный глобином, по сравнению с профилем экспрессии разности PBMC, предоставил окно в профили экспрессии эритроцитов в реальном времени при сосудистых заболеваниях. В клинических исследованиях гематологических заболеваний, таких как серповидноклеточная анемия, талассемия, G6PD, дефицит пируваткиназы и малярия где ранние предшественники красных кровяных телец являются основными источниками патофизиологии, понимание профиля транскрипции этих клеток может в значительной степени способствовать пониманию механизма заболевания, прогноза и ответов на терапию. Комбинация сокращения мРНК глобина после стабилизации РНК цельной крови представляет собой надежную методологию клинических исследований для обнаружения биомаркеров для гематологических заболеваний и в многоцентровых клинических испытаниях, исследующих широкий спектр негематологических нарушений, где фракционирование типов клеток практически невозможно.

Авторы хотели бы выразить признательность г-же Кимберли Вудхаус и д-ру Починг Лю в области геномического ядра за их техническую помощь в обработке образцов.

Конкурирующие интересы: авторы заявили, что конкурирующих интересов не существует.

Финансирование: интимные исследования NIH / NHLBI. Финансисты не играли никакой роли в разработке исследований, сборе и анализе данных, решении опубликовать или подготовить эту рукопись.

источник

Adblock
detector