Меню

Экспресс методы диагностики ботулизма

Лабораторная диагностика ботулизма

Ботулизм – острая пищевая интоксикация, протекающая с преимущественным поражением центральной и вегетативной нерв­ной системы ботулиническим токсином – силь­нейшим биологическим ядом, вырабатываемым палочкой ботулизма (Clostridium botulinum)и относящемся к особо опасным патогенным биологи­ческим агентам. Ботулизм может быть связан также с вегетацией возбудителя в ране или кишечнике.

Материалом для исследования являются кровь, моча, испражнения, промывные воды желудка, остатки пищи (мясные, рыбные, фруктовые, овощные, грибные консервы, колбасы и др.). Обычно у больного с подозрением на ботулизм исследуют на наличие токсина кровь, а на наличие возбудителя – испражнения.

Биопроба.Проводится реакция нейтрализации на белых мышах с целью обнаружения ботулотоксина в исследуемом материале. Обнаружение токсина палочки ботулизма и его типа имеет важное значение для назначения пациенту антитоксической противоботулинистической сыворотки – един­ственного эффективного средства специфической терапии и экстренной профи­лактики ботулизма. Реакцию ставят со смесью антитоксических противоботулинистических сывороток, а также с моновалентными сыворотками типов А, В, Е. При наличии в исследуемом материале ботулотоксинамыши контрольной группы погибают с явлениями параличей (парез конечностей, осиная талия и т.д.). При нейтрализации токсина антитоксической сывороткой мыши остаются живыми.

Экспресс-диагностика ботулизмапроводится с помощью РНГА с антительными эритроцитарными диагностикумами для обнаружения ботулотоксина в исследуемом материале.

Бактериологический метод.Исследуемый материал засе­вают в 4 флакона со средой Китта –Тароцци; один флакон прогре­вают при температуре 60 0 С в течение 15 мин (для селекции С. botulinum типа Е), другой – при 80 0 С в течение 20 мин. Накопление куль­тур клостридий ботулизма типов Е и F происходит при 28 °С, а клостридий типа А и В при 35 °С в течение 48 ч. Для активации токсина Е к питательной среде добавляют трипсин.

Через 24 — 48 ч инкубирования учитывают характер роста посевов (помутнение и газообразование), готовят мазки в окраске по Граму. При наличии типичных бактерий в виде «теннисных ракеток» со спорами (рис.15) делают пересев на кровяной сахарный МПА, на котором С. botulinumобразует колонии неправильной формы с гладкой или шероховатой поверхностью и зоной гемолиза. В глубине столбика сахарного МПА колонии палочки ботулизма имеют вид пушинок или чечевичек.

Рис. 15. Палочка ботулизма – Clostridium botulinum. Окраска по Граму. Грамположительные спорообразующие палочки в виде «теннисной» ракетки. х900

Идентификация чистой культуры проводится на основании изучения биохимических свойств (посев в сре­ды «пестрого» ряда), изучают другие дифференциальные призна­ки (см. табл.). Антигенные свойства культуры изучают с помощью РА с типовыми сыворотками. Выявля­ют также ботулинический токсин в фильтрате бульонной культуры и его тип с помощью реакции нейтрализации на белых мышах.

Не нашли то, что искали? Воспользуйтесь поиском:

Лучшие изречения: При сдаче лабораторной работы, студент делает вид, что все знает; преподаватель делает вид, что верит ему. 9777 – | 7480 – или читать все.

источник

Разработан экспресс-метод диагностики ботулизма

Французские ученые разработали принципиально новый, значительно более быстрый и высокоточный, чем существующий, метод диагностики ботулизма. Чип с нанесенным на него белком, с которым вступает во взаимодействие ботулотоксин, позволяет выявить присутствие даже очень низких концентраций яда в крови в течение не четырех дней, как сейчас, а нескольких часов. Метод описан в публикации в журнале Biosensors and Bioelectronics.

Ботулотоксин – белковый нейротоксин, вырабатываемый спорообразующими бактериями Clostridium botulinum – является одним из сильнейших известных науке ядов. Попадая в организм, чаще всего при употреблении продуктов домашнего консервирования, где в анаэробных условиях произошло размножение бактерии, ботулотоксин вызывает тяжелое поражение нервной системы, прогрессирующий паралич, острую дыхательную недостаточность и смерть. Летальность в случае несвоевременного начала лечения составляет 60 процентов. В том случае, если диагноз поставлен вовремя и начата адекватная терапия, вероятность летального исхода падает ниже 5 процентов.

В настоящее время стандартным методом диагностики ботулизма является занимающий четыре дня тест на лабораторных мышах, когда присутствие токсина в сыворотке крови больного выявляют, вводя ее в организм животных. Если у грызунов развиваются симптомы заболевания и они погибают, тест считается положительным. Однако этот метод, помимо излишней и зачастую губительной для пациента длительности, часто бывает неточным при относительно низкой концентрации яда в крови.

Группа специалистов под руководством молекулярного нейробиолога Кристиана Левека (Christian Lévêque) из Биомедицинского исследовательского агентства при институте INSERM (Марсель, Франция) предприняли попытку преодолеть эти недостатки, сфокусировавшись на молекулярных процессах, лежащих в основе нейротоксичного действия ботулотоксина. При этом в качестве объекта они выбрали наиболее распространенный тип яда, ботулотоксин А.

В своей работе Левек и его коллеги исходили из представления о том, что поражающее действие ботулотоксина А на нервную систему, следствием которого является паралич, обусловлено расщеплением им белка SNAP-25, играющего ключевую роль в процессе передачи нервных импульсов в мышцы. Исследователи нанесли SNAP-25 на тонкий, двухсантиметровой ширины, чип и подвергли его воздействию крови, зараженной ботулотоксином А. Для выявления присутствия яда авторы разработали биоинженерное моноклональное антитело, вступающее в специфическую реакцию с продуктами расщепления SNAP-25 ботулотоксином А. Наличие такой реакции означает, что в крови присутствует токсин. С помощью такого тестирования, которое занимает в общей сложности около пяти часов, авторам удалось со стопроцентной точностью (в 11 случаях из 11) выявить заражение даже при очень низких концентрациях ботулотоксина А в крови, без единого ложнопозитивного результата в контрольной группе, в которую входили здоровые люди и пациенты с поражением нервной системы другой природы.

В настоящее время, как пишет журнал Science, группа Левека занята проведением более широкомасштабных лабораторных испытаний метода, призванных подтвердить его эффективность, прежде чем вводить его в клиническую практику. Кроме того, исследователи намерены попробовать применить аналогичный способ для выявления других типов ботулотоксина.

источник

Как распознать ботулизм

Ботулизм развивается из-за попадания в организм ботулотоксина, который относится к одному из наиболее ядовитых биологических веществ. Выделяется токсин в процессе жизнедеятельности спорообразующей палочки, размножающейся в безвоздушной среде.

Попадает инфекция в организм человека при употреблении консервов домашнего приготовления, поскольку яд длительное время существует в рассолах, консервах и пищевых продуктах, содержащих различные специи. Пищевая токсикоинфекция поражает нервную систему, что может привести к остановке дыхания или сердцебиения, поэтому каждый, кто любит домашние консервы, должен знать, как определить ботулизм.

Что позволяет заподозрить развитие ботулизма

Диагностика ботулизма начинается с изучения эпидемиологического анамнеза и клинической картины заболевания. Инфекция передается фекально-оральным путем, то есть вместе с продуктами питания, недостаточно отчищенными от почвы. В подавляющем большинстве случаев, причиной болезни выступает употребление приготовленных в домашних условиях консервированных продуктов, которые были загрязнены спорами клостридий.

Токсин может находиться в банках с огурцами, помидорами, грибами и любыми другими продуктами, содержащими рассол. Необходимым условием для размножения бактерии является отсутствие кислорода, поэтому они накапливаются только в плотно закрытых банках. Если заболевший ел в течение последних 10 дней консервированные овощи, грибы, мясные изделия или соленую рыбу, то есть вероятность, что он заразился токсикоинфекцией.

Люди высоковосприимчивы к ботулотоксину, а значит, даже небольшие его дозы способны приводить к появлению клинических симптомов. Затрудняет диагностику ботулизма то, что не все, кто ел продукты из банки, заражаются, поскольку токсин концентрируется в определенном месте и достаточно минимального количества, чтобы развилась патология.

Вместе с тем часто бывают случаи семейного поражения ботулизмом после употребления долго хранившихся консервированных продуктов. В редких случаях заражение ботулотоксином происходит при контакте обсемененной жидкости с ранами и гнойниками, развивается так называемый раневый ботулизм. Поэтому нельзя даже открывать подозрительную банку с консервами.

Симптомы ботулизма

Токсин в начале заболевания может спровоцировать развитие гастроэнтерологического, глазного синдрома или острую дыхательную недостаточность. Чаще всего развивается гастроэнтерологический вариант, который протекает, как пищевая токсикоинфекция. Больной ощущает боль в верхней части живота, появляется тошнота, рвота, диарея, кожа быстро становится сухой из-за потери жидкости, нередко заболевшие говорят о том, что стало больно глотать.

В продромальный период ботулизма, протекающего по глазному варианту, больные жалуются на нарушение зрения (появление черных точек, затуманивание, утрата четкости и остроты зрения, развитие острой дальнозоркости). Даже на начальном этапе болезни может возникнуть острая дыхательная недостаточность, которая способна приводить к летальному исходу в течение 3–4 часов, поэтому если внезапно появилась и увеличивается отдышка, кожа и слизистая оболочка становятся синюшными, то срочно необходима медицинская помощь.

В разгар болезни появляются специфические для ботулизма симптомы: парезы и параличи мышц различных групп. У больных возникает офтальмоплегия (паралич мышц глаз), что может проявляться расширением зрачков, косоглазием, вертикальным нистагмом, опущением века.

Из-за пареза мышц глотки развивается дисфагия (нарушение глотания), что приводит к невозможности проглатывания пищи и жидкости. Ботулотоксин провоцирует и ослабление иннервации мимических мышц, что проявляется в асимметрии лица. Походка больных неустойчива, отмечается общая слабость. Парез мышц кишечника приводит к развитию запора.

Последовательно нарушается речь. Сначала у больного изменяется голос из-за сухости слизистой голосовых связок. Когда развивается парез мышц языка, человек не может внятно говорить. По мере прогрессирования болезни возникает парез мышц небной занавески, что делает голос гнусавым, а когда ослабевают голосовые связки, голос исчезает вовсе.

Таким образом, заподозрить развитие ботулизма можно, если больной недавно употреблял консервированные продукты, а симптомы указывают на нарушение иннервации различных групп мышц (глазных, лицевых, голосовых). При подозрении на ботулизм необходимо срочно обратиться к врачу. Специалисты проведут дифференциальную диагностику, а с помощью микробиологии будет подтверждено или опровергнуто присутствие яда в организме.

Как подтверждается диагноз

Дифференциальная диагностика проводится на начальном этапе заболевания, когда клиническая картина еще не включает специфические симптомы ботулизма. Первые признаки болезни, такие как понос, рвота, тошнота, слабость характерны для многих кишечных инфекционных заболеваний и пищевых отравлений.

Паралич глазных мышц может возникнуть в результате новообразования, отравления свинцом, алкоголем, барбитуратами, поражения головного мозга (ЧМТ, инсульт, энцефалит), заражения столбняком, дифтерией и прочими инфекционными болезнями. Дыхательная недостаточность развивается при заболеваниях бронхолегочной системы и поражениях ЦНС.

Диф. диагностика ботулизма требует исключение:

  • миастении;
  • вирусного энцефалита;
  • дерматомиозита;
  • синдрома Гийена-Баре;
  • синдрома Вернике;
  • полиомиелита;
  • отравления грибами или атропином.

Лабораторные методы

Специфическая лабораторная диагностика ботулизма на начальной стадии болезни не разработана, поэтому дифдиагностика основывается на данных эпидемиологического анамнеза (употреблении консервированных продуктов, алкоголя, получения черепно-мозговой травмы).

По мере развития ботулизма появляются характерные симптомы, которые и помогают дифференцировать болезнь (сохранность сознания и чувствительности, отсутствие жара и лихорадки, мышечные параличи). Дальнейшая диагностика проводится для определения типа токсина (А, В, С, Е, F) и подтверждения диагноза. При подозрении на ботулизм у больного берут анализ крови и мочи, и хотя исследования не являются специфичными, но они помогают установить тяжесть течения болезни.

Микробиологическая диагностика ботулизма позволяет обнаружить токсин в рвотных массах, кале, крови, моче, промывных водах желудка, остатках продуктов. Для определения вида яда используют бактериологический и биологический метод, а также устанавливают фагоцитарный показатель.

При использовании бактериологического метода взятый материал смешивают в стерильной емкости с физиологическим раствором хлорида натрия. Затем высевают материал на питательную среду в четыре пробирки. Два образца нагревают при температуре 60 ⁰С в течение 15 минут, что позволит обнаружить бактерию типа Е.

А остальные две пробирки нагревают 20 минут при 80 ⁰С. Размножаются бактерии типа Е и F при 28 ⁰С, а типа А, В, С при 35 ⁰С за 48 часов. Через 1–2 суток оценивают характер роста и проводят окрашивание мазков по Граму. После выделения чистой культуры изучают ее антигенные свойства с помощью реакции агглютинации с типовыми сыворотками.

Биологический метод предполагает определение типа токсина с помощью реакции нейтрализации, что важно для специфического лечения. Для обнаружения реакции нейтрализации применяют сухие диагностические антитоксические сыворотки, которые смешивают с физиологическим раствором. Если сыворотка действует, то в исследуемой пробе токсин нейтрализуется.

Материал для исследования помещают в 6 пробирок, в пять из них добавляют противоботулинические сыворотки типа А, В, С, Е, F, а в шестую нормальную сыворотку. Пробирки опускают в термостат на 30 минут, а затем вводят по 1 мл жидкости белым мышам. Грызуны, которым была введена подходящая противоботулиническая сыворотка, не погибают.

Ботулинический токсин снижает фагоцитарную активность лейкоцитов. Для выявления данного свойства кровь предполагаемого больного смешивают с цитратом натрия, в пробирки добавляют поливалентную или типовую сыворотку и помещают в термостат на полчаса, для уничтожения токсина. Затем в исследуемый материал вводит стафилококк и опять опускают в термостат на 20 минут для окончания фагоцитоза.

Делают мазок из каждого образца и подсчитывают количество стафилококков, захваченных в среднем одним лейкоцитом. Если в крови присутствовал ботулинический токсин, то фагоцитарный показатель низкий. Если же добавлялась типовая сыворотка в пробирки, то там, где сыворотка соответствовала токсину, произойдет нейтрализация и фагоцитарный показатель будет существенно выше.

В разгар заболевания можно обнаружить токсин в крови с помощью РОПГА с антительным эритроцитарным диагносикумом. Дело в том, что эритроциты сенсибилизируются специфическими антителами и склеивание происходит, если в образце материала присутствуют антигены. Тест позволяет обнаружить даже минимальное количество токсина в исследуемом материале, поскольку обладает высокой чувствительностью и специфичностью.

В кровь, взятую из вены, добавляют антитела, которые помечены ферментами. На них реагируют бактериальные антигены и образуют с ними иммунные комплексы, что вызывает изменение цвета материала. Специалисты по интенсивности окраски делают вывод о присутствии в образце специфических антител к ботулистическому токсину.

Метод дот-иммуноанализа позволяет распознать ботулизм уже через три часа после получения для исследования материала. С помощью теста можно проверить на токсины не только кровь, но и продукты питания, которые предположительно стали источником инфекции.

На нитроцеллюлозный мембранный фильтр, на котором находятся меченные противоботулиническе антитела, наносится исследуемый материал. После этого, фильтр обрабатывают специальным составом, который темнеет, если в жидкостях присутствует токсин. Концентрация яда определяется при сравнении с контрольной школой.

Лабораторная диагностика ботулизма подтвердит или опровергнет заболевание, что необходимо для назначения адекватного лечения, которое заключается в приеме противоботулинической сыворотки. На сегодняшний день не составляет труда определить присутствие в крови ботулотоксина, но заболевание развивается стремительно, поэтому необходимо знать, как распознать болезнь, чтобы вовремя обратиться к врачу.

источник

Экспресс методы диагностики ботулизма

Нанотехнологии в медицине
Экспресс-диагностика токсинов ботулизма c помощью микрочипов

П.Ляхов, под редакцией П.Горелова
Москва 2014
Введение

Ботулизм – опасное для жизни человека инфекционное заболевание. В случае несвоевременной диагностики инфекции летальный исход возможен в 60 % случаев. Болезнь развивается стремительно – нередко всего за несколько часов после попадания возбудителя в организм человека, поэтому очень важно на ранней стадии поставить точный диагноз.
Поскольку традиционные лабораторные методики диагностики занимают больше одного дня, большой интерес представляют новые приборы, выполняющие экспресс-анализ с помощью микрочипов. В частности, анализатор токсинов и патогенов ePaTOX II позволяет определить ботулинический токсин типа A, В, Е и F в течение 20 минут, провести своевременные мероприятия по его нейтрализации и облегчить страдания больных.

Павел Ляхов. “Shadows of the Past”. Холст, масло. 73,5х81 см. 2006 г.

Ботули́зм (от лат. botulus — колбаса) — тяжелое токсико-инфекционное заболевание, характеризующееся поражением нервной системы (преимущественно продолговатого и спинного мозга). Источником заражения могут быть пищевые продукты, вода, аэрозоли, содержащие ботулотоксин, который продуцируется спорообразующей палочкой Clostridium botulinum. Несмотря на то, что случаи заболевания ботулизмом регистрируется реже, чем другие кишечные инфекции и отравления, болезнь продолжает оставаться опасной для жизни человека 2.

Отравление токсином возможно только при употреблении продуктов, в которых в анаэробных условиях произошло размножение Cl.botulinum и накопление токсина. Обычно такие условия возникают при несоблюдении санитарных норм приготовления пищи. Часто источником токсина становятся консервы домашнего производства [5].

Известно семь типов возбудителя — А, В, С (подтипы С1 и С2), D, Е, F и G, различающиеся по антигенной структуре выделяемого экзотоксина [6]. Вспышки ботулизма чаще всего вызваны токсином типа А, реже – типами В, С, E и F. Токсин D вызывает заболевания только у животных и водоплавающих птиц [1].

Симптомы заболевания ботулизмом проявляются внезапно – это сухость во рту, слабость в мышцах, нарушение зрения, затруднение глотания, изменение высоты и тембра голоса, учащенное дыхание. Болезнь развивается стремительно и может продлиться от одного до двух месяцев. Летальные исходы возникают в основном вследствие дыхательной недостаточности. Инкубационный период протекает от нескольких часов до 2-5 дней, составляя в среднем 18-24 часов.

Павел Ляхов. ИНТЕРЕСНЫЙ РЕЗУЛЬТАТ Бумага, акварель. 85,8х61 см. 2009 г.

Используемые сегодня методы диагностики ботулизма характеризуются длительностью анализа от 1 до 10 дней, что как минимум в два раза дольше инкубационного периода заболевания. Материалом для бактериологического исследования служат фекалии и рвотные массы больного, промывные воды желудка и кишечника, содержимое ран (при раневом ботулизме), подозреваемая пища [7].

Известны следующие методы диагностики токсина ботулизма [8]:

• клинические – наблюдение за зараженными возбудителем подопытными животными (белыми мышами, морскими свинками, кроликами), взятие крови, гипериммунизация;

• бактериологические – посевы Cl.botulinum на МПА с 2% глюкозой в среду Китта-Тароцци, бульон Хоттингера с 1% глюкозой, выделение чистых культур, получение и наработка бактериальной массы и продуцируемого токсина;

• культурально-морфологические и биохимические – изучение сахаролитических и протеолитических свойств штаммов Cl.botulinum;

• микроскопические – световая и люминесцентная микроскопия;

• серологические – постановка РН, РНГА, ИФА;

• радиобиологические – инактивация возбудителя Cl.Botulinum на гамма-установке “Исследователь” с источником излучения 60 Сo;

• химические – инактивация возбудителя Cl.botulinum и перевод токсинов в анатоксины с использованием 40% раствора формалина;

• диагностика с использованием микрочипов [9].

Диагностика с использованием микрочипов

Наиболее современный метод диагностики ботулизма основан на использовании приборов со специальными микрочипами. В частности, этот принцип реализован в универсальном портативном анализаторе ePaTOX II, который предназначен для высокочувствительного обнаружения белков, токсинов, нуклеиновых кислот и других биомолекул в образцах разных видов. Прибор позволяет определить ботулинический токсин типов А, В, Е и F, и может использоваться как в стационарных лабораториях, так и в переносных системах [9].

Принцип чип-обнаружения в ePaTOX II основывается на электрохимической реакции. Для ее проведения используют микросхемы с наноразмерной структурой электродов, изготовленных на кремнии по современной полупроводниковой технологии.

Биочип содержит 16 точек измерения, заполненных различными рецепторными молекулами. Конфигурация биочипа позволяет параллельно выявлять несколько токсинов или патогенов. Исследуемый образец в ходе анализа автоматически покрывает всю поверхность чипа, что дает возможность молекулам-мишеням связываться с комплементарными рецепторными молекулами (например, с антителами, олигонуклеотидами), которые иммобилизуются на поверхности чипа. Затем следует маркировка энзимов.

Фиксируемый на чипе энзим преобразуется в субстрат, который может быть идентифицирован в результате электрохимической реакции. Электродная структура на чипе позволяет измерять электрический сигнал, величина которого прямо пропорциональна концентрации молекул-мишеней в образце. Электрохимический принцип обнаружения позволяет достичь высокой аналитической точности, а результирующая система не подвержена оптическим помехам, например помутнению. Полное время анализа при обнаружении ботулинических токсинов занимает около 20 минут.

ePaTOX II прост в использовании и комплектуется интуитивно понятным аналитическим программным обеспечением.

Таким образом, современный инновационный метод диагностики ботулизма с помощью анализатора токсинов и патогенов на основе микрочипа позволяет значительно сократить время анализа и своевременно приступить к лечению инфекции, облегчив течение заболевания. Также возможна профилактика путем анализа пищевых продуктов на наличие ботулотоксина, что дает возможность предотвратить заболевание. Чувствительность определения ботулинических токсинов с помощью прибора ePaTOX II

источник

Adblock
detector