Меню

Аллергологический метод диагностики бруцеллеза

АЛЛЕРГИЧЕСКИЙ МЕТОД ДИАГНОСТИКИ БРУЦЕЛЛЕЗА ЖИВОТНЫХ

5.1. Метод аллергического исследования основан на выявлении у больных бруцеллезом

животных повышенной чувствительности замедленного типа к специфическому аллергену.

5.2. Аллергический метод применяют для исследования на бруцеллез крупного рогатого скота,

буйволов, овец, коз, свиней и северных оленей, не подвергавшихся прививке вакцинами против

бруцеллеза, в случаях, предусмотренных инструкцией о мероприятиях по профилактике и

ликвидации бруцеллеза животных.

Аллергическое исследование на бруцеллез животных разрешается проводить только

ветеринарным врачам или фельдшерам со средним специальным образованием под наблюдением

5.3. Для аллергической диагностики бруцеллеза у животных применяют бруцеллин ВИЭВ.

Бруцеллин – стерильный биологический препарат, представляет собой прозрачную жидкость

коричневато-желтого цвета без опалесценции, содержащую продукты жизнедеятельности и

специфические вещества, извлеченные из бруцелл.

Флаконы с бруцеллином должны быть плотно закрыты пробками и закатаны алюминиевыми

колпачками. При встряхивании и переворачивании флакона препарат не должен просачиваться через

пробку. На каждом флаконе должна быть этикетка (или надпись) с обозначением наименования

биопредприятия, изготовившего бруцеллин, наименования препарата и его количества, номера

Не является официальной версией, бесплатно предоставляется членам Ассоциации лесопользователей Приладожья, Поморья и Прионежья – www.alppp.ru. Постоянно действующий третейский суд.

серии, даты выпуска, срока годности, номера госконтроля, условий хранения, стандарта (ГОСТ) и

5.4. Бруцеллин используют только в день вскрытия флакона. Он пригоден для применения в

течение 18 месяцев со дня изготовления при условии хранения в темном сухом помещении при

5.5. Каждый флакон с бруцеллином перед применением просматривают. При обнаружении в

препарате каких-либо примесей, плесени, хлопьев, при нарушении целостности стекла или укупорки,

отсутствии надписи на флаконе, а также бруцеллин, подвергавшийся замораживанию и давший

осадок или помутнение, к применению не допускается.

5.6. Для введения животным бруцеллина используют короткие инъекционные иглы (N 0420 –

0813) или иглы для внутрикожных инъекций с двумя трубками (N 0706, ТУ 46-22-607-80) и шприцы,

снабженные бегунком, вместимостью 2 или 5 мл. При исследовании свиней можно применять

Шприцы и иглы перед и после их использования стерилизуют кипячением в течение 30 минут в

дистиллированной или кипяченой воде без добавления дезинфицирующих средств. Безыгольные

инъекторы стерилизуют в соответствии с инструкцией по их использованию.

Во время исследования животных инъекционные иглы меняют перед каждым наполнением

шприца бруцеллином, а в промежутках между инъекциями препарата иглу держат в ватном тампоне,

5.7. Непосредственно перед применением бруцеллина алюминиевый колпачок флакона с

препаратом приоткрывают, резиновую пробку обрабатывают спиртом, прокалывают инъекционной

иглой и шприцем через нее набирают необходимое количество аллергена.

Бруцеллин вводят животным под кожу нижнего века на 1 см ниже края века со стороны

наружного угла глаза (пальпебральная проба): овцам, козам и оленям в дозе 0,5 мл, крупному

рогатому скоту и буйволам в дозе 1,0 мл.

Вводить бруцеллин под кожу века, имеющую травматические повреждения, уплотнения,

абсцессы и другие поражения, не разрешается. Животных с заболеванием глаз или с густым

шерстным покровом в области век метят и вводят им бруцеллин внутрикожно в центре одной из

подхвостовых складок в дозах: овцам и козам – 0,2 мл и крупному рогатому скоту и буйволам – 0,3 мл

Свиньям бруцеллин вводят внутрикожно с наружной стороны ушной раковины, ближе к

основанию уха в дозе 0,2 мл. Правильность внутрикожной инъекции препарата контролируют по

образованию бугорка размером с горошину.

При инъекции препарата животным обязательно соблюдение правил асептики. Участок кожи

перед уколом протирают ватой, смоченной в спирте или 3-процентном растворе борной кислоты.

5.8. У животных, больных бруцеллезом, на месте введения бруцеллина наступает

воспалительная реакция в виде плотной или тестоватой припухлости, обычно хорошо видимой при

осмотре; у свиней, кроме того, может развиваться гиперемия, иногда кровоизлияние в виде темно-

красного пятна в центре отека. У здоровых животных местная реакция не возникает.

5.9. Реакцию на бруцеллин у овец, коз, оленей, крупного рогатого скота и буйволов учитывают

один раз через 48 часов, у свиней – два раза, через 24 и 48 часов после введения препарата, путем

осмотра, а при неясно выраженной реакции – пальпацией места инъекции.

Не является официальной версией, бесплатно предоставляется членам Ассоциации лесопользователей Приладожья, Поморья и Прионежья – www.alppp.ru. Постоянно действующий третейский суд.

При обнаружении на месте введения препарата припухлости реакцию оценивают как

В случае неясно выраженной реакции пальпируют место введения препарата и сравнивают с

кожей века другого глаза (или подхвостовой складки), а у свиней – с кожей основания другого уха.

Если обнаруживают хотя бы небольшую разницу, реакцию считают положительной. При отсутствии

указанных признаков реакции результат исследования считают отрицательным.

Реагирующих на бруцеллин животных метят и выделяют из отары (стада).

5.10. С животными, признанными при исследовании бруцеллина реагирующими

положительно, поступают согласно Инструкции о мероприятиях по профилактике и ликвидации

5.11. После применения бруцеллина у животных можно в любые сроки брать кровь для

исследования на бруцеллез серологическими методами.

5.12. Проведение аллергического исследования на бруцеллез животных оформляют актом с

приложением к нему описи реагировавших животных (указывают инвентарный номер, пол и возраст

животных, характер реакции на бруцеллин). Один экземпляр акта направляют главному ветврачу

района, другой хранят в хозяйстве.

С выходом настоящих Методических указаний утрачивают силу:

“Наставление по лабораторной диагностике бруцеллеза сельскохозяйственных животных” от 17

“Наставление по диагностике бруцеллеза у коров методом кольцевой реакции (КР) с молоком”

“Наставление по применению бруцеллина ВИЭВ для аллергической диагностики бруцеллеза у

мелкого рогатого скота и свиней” от 24 декабря 1969 г.;

“Временное наставление по клинической и лабораторной диагностике инфекционного

заболевания овец, вызываемого бруцеллой овис (инфекционный эпидидимит баранов)” (приложение

к циркулярному письму Главного управления ветеринарии МСХ СССР от 10 марта 1970 г. N 116-9);

“Наставление по постановке и учету реакции агглютинации при диагностике бруцеллеза

сельскохозяйственных животных” от 19 мая 1964 г. с изменениями и дополнениями, внесенными 11

“Наставление по постановке и учету реакции связывания комплемента (РСК) и реакции

длительного связывания комплемента (РДСК) при диагностике бруцеллеза у животных” от 27 мая

“Наставление по постановке и учету пластинчатой реакции агглютинации с роз бенгал

антигеном (роз бенгал проба или РБП) при диагностике бруцеллеза у животных” от 12 декабря 1978 г.

Указания по диагностике бруцеллеза животных разработаны Всесоюзным Ордена Ленина

научно-исследовательским институтом экспериментальной ветеринарии имени Я.Р. Коваленко

(проф. П.С. Уласевич, кандидаты вет. наук А.Н. Касьянов и В.А. Ромахов), Всесоюзным

государственным ордена Трудового Красного Знамени научно-контрольным институтом

ветеринарных препаратов МСХ СССР (канд. вет. наук К.В. Шумилов), Главным управлением

Не является официальной версией, бесплатно предоставляется членам Ассоциации лесопользователей Приладожья, Поморья и Прионежья – www.alppp.ru. Постоянно действующий третейский суд.

ветеринарии Министерства сельского хозяйства СССР (Э.С. Плотников) и Центральной

ветеринарной лабораторией (Б.И. Антонов, Т.А. Сысоева, В.В. Борисова).

источник

Аллергологический метод диагностики бруцеллеза

Тестами, выявляющими повышенную сенсибилизацию организма к бруцеллезному антигену, являются: внутрикожная аллергическая проба Бюрне, опсопофагоцитарная реакция (ОФР), реакция лизиса нейтрофилов.

а) Внутрикожная аллергическая проба Бюрне. Проба основана на способности организма, сенсибилизированного бруцеллезным антигеном, специфически отвечать местной реакцией (отек, болезненность) на внутрикожное введение бруцеллина, который представляет собой фильтрат трехнедельной бульонной культуры бруцелл.

Бруцеллин вводят внутрикожно в объеме 0,1 мл в ладонную поверхность предплечья. Учет реакции производят через 24-48 ч. Учитывается только размер отека в сантиметрах. В некоторых случаях аллергическая реакция становится положительной через 72 ч. Гиперемию кожи при отсутствии отека принимают за отрицательный результат. Реакция, появившаяся и исчезнувшая ранее 6 ч после введения бруцеллина, считается неспецифической.

Слабоположительной считается проба при отеке не более 2 см в диаметре, положительной — 2-6 см, резко положительной — свыше 6 см.

Введение специфического антигена в сенсибилизированный организм небезразлично для обследуемого. В этой связи заслуживают внимание эффективные методы выявления гиперчувствительности замедленного типа методом in vitro.

б) Опсонофагоцитарная реакция (ОФР). Проба основана на способности полинуклеарных нейтрофилов крови зараженного бруцеллезом организма фагоцитировать бруцеллы in vitro.

В пробирку, содержащую 0,2 мл 2%-ного раствора лимонно-кислого натрия, добавляют 0,4 мл исследуемой крови и 0,2 мл специального антигена для ОФР [4х 10 9 микробных клеток бруцелл (штамм B.abortus 19), убитых нагреванием, в 1 мл 0,9%-ного раствора натрия хлорида]. Содержимое пробирок перемешивают и 30 мин инкубируют в термостате при температуре 37″С. Затем из содержимого пробирок готовят мазки, как для подсчета лейкоцитов, фиксируют их и окрашивают по Козловскому или синькой Мансона.

Учет результатов производят путем подсчета количества фагоцитированных одним нейтрофилом бруцелл в учтенных подряд 25 нейтрофильных полинуклеарах. У здоровых людей фагоцитарный индекс в отношении бруцелл равен 0-5. Фагоцитарный индекс, равный 5-20, характеризует слабовыраженную реакцию; 21-40 — умеренную; свыше 40 — выраженную.

в) Реакция лизиса лейкоцитов основана на учете разрушения лейкоцитов сенсибилизированного организма под влиянием специфического антигена. Обладает строгой специфичностью. Позволяет получить результаты в короткие сроки — через 3-4 ч после взятия крови.

Реакция проводится в пробирках из химически чистого стекла. В качестве антигена используется взвесь убитых нагреванием бруцелл (штамм В. abortus 19) в концентрации 1х10 7 микробных клеток/мл.

Кровь для исследования берут в количестве 1 мл и вносят в колбочку с гепарином из расчета 75-80 ME гепарина на 1 мл крови. В две пробирки переносят по 0,4 мл гепаринизированной крови. В первую пробирку добавляют 0,1 мл бруцеллезного антигена (опытная пробирка), во вторую — 0,1 мл 0,9%-ного раствора натрия хлорида для установления неспецифического лизиса лейкоцитов (контрольная пробирка). Пробирки встряхивают в течение 2-3 мин и подсчитывают лейкоциты в камере Горяева. Затем пробирки инкубируют в термостате в течение 2 ч при температуре 37°С, периодически встряхивая.

После инкубации пробирки вновь встряхивают в течение 2-3 мин и подсчитывают лейкоциты. Подсчет производится двух-, трехкратно для каждой пробирки, затем выводится средний показатель.

Процент уменьшения количества лейкоцитов после инкубации в опытной и контрольной пробирках подсчитывают по формуле: (количество лейкоцитов после инкубации: количество лейкоцитов до инкубации) х 100%.

Показатель специфического лизиса лейкоцитов рассчитывают путем определения разницы между процентом уменьшения лейкоцитов в опытной пробирке и процентом уменьшения лейкоцитов в контроле. Он выражается отрицательной величиной и колеблется в пределах от -10 до -30%. Показатель меньше -10% свидетельствует о неспецифическом лизисе.

Например: если процент уменьшения количества лейкоцитов в опыте (% Оп) составляет 74,5%, а процент уменьшения количества лейкоцитов в контроле (% К) — 96,5 %, то показатель специфического лизиса равняется: 74,5 – 96,5 = – 22 (%) -реакция специфическая.

Серологические реакции и аллергическая кожная проба в различные периоды заболевания не равноценны по своему диагностическому значению и не могут заменять друг друга. Максимальная диагностическая достоверность при иммунологических исследованиях на бруцеллез достигается лишь путем применения комплексной сероаллергической диагностики, так как выраженность этих реакций на разных этапах развития инфекционного процесса неодинакова.

Соотношение между положительными и отрицательными результатами реакций по мере увеличения сроков от начала заболевания меняется закономерно. В ранние сроки от начала заболевания диагностическая ценность серологических методов выше, чем аллергологического. По мере отдаления от начала заболевания бульшую диагностическую ценность представляет внутрикожная аллергическая проба Бюрне, реакция Кумбса, ИФА.

Примечание: При обострении инфекционного процесса, а также при суперинфекции утраченная серологическая реакция может восстановиться.

Редактор: Искандер Милевски. Дата публикации: 28.1.2020

источник

Аллергологический метод диагностики бруцеллеза

Серологический метод включает реакции, выявляющие специфические бруцеллезные антитела: пластинчатую реакцию агглютинации (РА), пробирочную РА (Райта), реакцию непрямой гемагглютинации (РИГА), антиглобулиновую пробу (реакция Кумбса), иммуноферментный анализ (ИФА), реакцию непрямой иммунофлуоресценции (РНИФ).

а) Пластинчатая РА (реакция Хеддльсона). Преимущество этого метода заключается в простоте постановки реакции, быстроте получения результатов и чувствительности реакции. В качестве антигена для постановки реакции Хеддльсона и Райта применяют диагностикум бруцеллезный жидкий для РА.

Реакцию ставят на обычном оконном тщательно вымытом обезжиренном стекле, расчерченном на квадраты величиной 4×4 см каждый — 5 квадратов по горизонтали. В первый квадрат с левой стороны вписывают номер испытуемой сыворотки, в последующие квадраты слева направо разливают испытуемую сыворотку в дозах 0,04; 0,02; 0,01 и 0,03 мл (контроль сыворотки).

К первым трем дозам сыворотки добавляют по 0,03 мл диагностикума, к последней дозе сыворотки — 0,03 мл 0,9%-ного раствора натрия хлорида. Сыворотку осторожно смешивают с диагностикумом палочкой, начиная с минимальной дозы сыворотки. Контроль антигена ставят, добавляя 0,03 мл 0,9%-ного раствора натрия хлорида к 0,03 мл цельного диагностикума. Стекло слегка подогревают над пламенем спиртовки так, чтобы происходило равномерное нагревание всей поверхности стекла.

В случае положительной реакции в течение первых минут в каплях сыворотки появляются хлопья (агглютинат) и отмечается просветление жидкости. Максимальный срок наблюдения — 8 мин.

Контроль сыворотки ставят с каждой испытуемой сывороткой для исключения спонтанной агглютинации. Контроль антигена (диагностикума) ставят один для исключения спонтанной агглютинации применяемого антигена.

Учет реакции проводят невооруженным глазом:

– 4+ (100% агглютинации) — полное просветление жидкости с крупными и мелкими хлопьями;

– 3+ (75% агглютинации) — почти полное просветление жидкости с ясно заметными хлопьями;

– 2+ (50% агглютинации) — незначительное просветление жидкости с заметными хлопьями;

– 1+ — мутная жидкость с едва заметной зернистостью;

– отрицательный результат — равномерно мутная жидкость.

Для трактовки результатов рекомендуется следующая схема:

– агглютинация на 4+ во всех дозах сыворотки — результат резко положительный;

– агглютинация не менее чем на 2+ во всех дозах сыворотки — результат положительный;

– агглютинация только в первой или в первой и второй дозах сыворотки — результат сомнительный;

– отсутствие агглютинации во всех дозах сыворотки — результат отрицательный.

Для диагностики бруцеллеза имеют значение только положительные результаты реакции агглютинации. При сомнительных или отрицательных результатах реакции и наличии эпидемических и эпизоотических показаний, а также в стационаре и при обследовании доноров, когда необходимо определение титра агглютининов и их динамики, следует применять реакции Райта и Кумбса, РНГА и ИФА.

б) Пробирочная РА (реакция Райта) является одним из основных методов диагностики бруцеллеза у людей. Наибольшую диагностическую ценность РА представляет при острой и подострой формах заболевания.

Реакцию ставят в пробирках, исследуемую сыворотку разводят 1:25 (0,1 мл цельной сыворотки + 2,4 мл 0,9%-ного раствора натрия хлорида) и титруют в объеме 0,5 мл в 0,9%-ном растворе натрия хлорида. Диагностикум бруцеллезный жидкий для РА разводят 1:10 и добавляют в том лее объеме. Полученную смесь встряхивают и помещают в термостат при температуре 37°С на 18-20 ч. Учет результатов производят после выдерживания пробирок в течение 2 ч при комнатной температуре.

Параллельно из диагностикума, используемого для постановки пробирочной РА и дополнительно разведенного 1:2, готовят стандарт мутности для учета результатов реакции, который помещают в термостат одновременно с основной реакцией.

Учет проводят путем сравнения опытных пробирок с приготовленным стандартом мутности, что позволяет объективно оценивать получаемые результаты агглютинации.

Диагностическим титром принято считать РА не менее чем на 2+ при разведении сыворотки 1:100 и выше.

Следует иметь в виду, что иногда слабоиоложительные результаты реакции на бруцеллез дают холерный и туляремийный антигены, а также Y. enterocolitica 09. Однако инактивация сыворотки при температуре 56-70°С исключает неспецифические показания РА.

в) Антиглобулиновая проба (реакция Кумбса), выявляющая неполные антитела, используется в диагностике бруцеллеза у людей, особенно при хроническом течении инфекции, когда РА может быть отрицательной или положительной в низких титрах.

Сущность реакции состоит в том, что на первом этапе в реакционной смеси происходит соединение неполных антител — глобулинов с бруцеллезным антигеном. Однако в этой фазе реакция остается невидимой. Для выявления комплекса антиген — антитело проводят второй этап реакции, для чего добавляют антиглобулиновую сыворотку. В случае положительного результата комплекс антиген — антитело выпадает в осадок.

При постановке реакции используют предварительно оттитрованную антиглобулиновую сыворотку против глобулинов человека. Для ее титрования необходимо иметь сыворотку крови человека, заведомо содержащую неполные антитела к бруцеллам в высоком титре. При этом первоначально титруют положительную бруцеллезную сыворотку в пробирочной РА по методике, описанной выше, делая до восьми рядов разведений сыворотки.

После учета РА (через 20 ч) отбирают пробирки, в которых отсутствует агглютинация (в нашем примере — начиная с разведения 1:400), и в каждой из них трехкратно отмывают антиген 0,9%-ным раствором натрия хлорида.

В дальнейшем делают несколько разведений титруемой антиглобулиновой сыворотки (в нашем примере от 1:10 до 1:250) и добавляют по 0,5 мл каждого разведения этой сыворотки в один ряд пробирок с антигеном, полученным после отмывания. Пробирки встряхивают и помещают в термостат при температуре 37″С. Результаты учитывают также как РА.

За титр антиглобулиновой сыворотки принимают ее наибольшее разведение (в нашем примере — 1:80, 4-й ряд), которое выявляет неполные антитела в максимальном титре (1:3200). Для реакции Кумбса антиглобулиновая сыворотка применяется в удвоенном титре (1:40).

Исследуемую сыворотку разводят 0,9%-ным раствором натрия хлорида 1:10 и ставят РА. После учета реакции (через 20 ч) отбирают пробирки (не менее грех из первых разведений), в которых зафиксирована слабоположительная реакция (+ или ++). Эти пробирки центрифугируют при 3000 об/мин в течение 20 мин для осаждения антигена. Супернатант удаляют, к осадку добавляют 1 мл 0,9%-ного раствора натрия хлорида, тщательно встряхивают и снова центрифугируют; таким образом, осадок отмывают трижды. После последнего центрифугирования к осадку отмытого антигена добавляют 0,5 мл антиглобулиновой сыворотки, оттитрованной специально для реакции Кумбса.

Пробирки выдерживают в термостате при температуре 37°С в течение 18-24 ч. Реакцию учитывают так же, как и РА.

Контроль антигена: 0,5 мл взвеси антигена в 0,9%-ном растворе натрия хлорида, подвергшегося отмыванию центрифугированием, и 0,5 мл антиглобулиновой сыворотки. При учете должно наблюдаться равномерное помутнение.

Для контроля антиглобулиновой сыворотки используют сыворотку, содержащую неполные антитела в известном титре.

Диагностическим титром реакции Кумбса считается агглютинация не менее чем на 2+ в разведении сыворотки 1:50.

г) Реакция непрямой гемагглютинации (РНГА) является специфичным и высоко чувствительным методом выявления бруцеллезных антител в сыворотке крови человека. Для постановки РНГА используется бруцеллезный эритроцитарный антигенный диагностикум, контрольные (десенсибилизированные) эритроциты, ИКС, бруцеллезная сыворотка.

При постановке реакции макрометодом исследуемую сыворотку разводят 0,9%-ным раствором натрия хлорида 1:25 (0,1 мл сыворотки + 2,4 мл 0,9%-ного раствора натрия хлорида) и инактивируют при температуре 56-60°С в течение 30 мин. Перед исследованием сыворотку адсорбируют 50%-ной взвесью контрольных эритроцитов, для чего к 1,2 мл инактивированной сыворотки добавляют 0,2 мл 50%-ной взвеси эритроцитов, встряхивают и оставляют на 30 мин при комнатной температуре. Затем смесь центрифугируют при 1000 об/мин в течение 2 мин.

Можно оставить сыворотки с эритроцитами на ночь в холодильнике (+4°С), что исключает этап центрифугирования.

Эритроцитарный диагностикум перед применением разводят 0,9%-ным раствором натрия хлорида согласно инструкции и получают 2,5%-ную взвесь, которая применяется в реакции. Контрольные (десенсибилизированные) эритроциты также разводят согласно инструкции и полученную 2,5%-ную взвесь используют для контроля сывороток.

Исследуемую сыворотку титруют, используя инактивированную НКС, предварительно разведенную 1:100, начиная с разведения 1:50 до 1:400 в объеме 0,5 мл. В каждую лунку добавляют 0,05 мл подготовленного эритроцитарного диагностикума. Пластинки осторожно встряхивают до полного перемешивания содержимого лунок и оставляют при комнатной температуре. Учет реакции производят через 2-3 ч.

При постановке реакции предусматриваются следующие контроли:

– контроль качества ИКС (1:1000) проводят в двух лунках. К 0,5 мл сыворотки добавляют в первую 0,05 мл 2,5%-ной взвеси эритроцитарного диагностикума, во вторую — 0,05 мл контрольных эритроцитов;

– контроль качества диагностикума осуществляют путем титрования специфической бруцеллезной сыворотки начиная с разведения 1:50 до 1:100 000. Затем в каждую лунку добавляют по 0,05 мл 2,5%-ной взвеси эритроцитарного диагностикума.

Реакция считается специфической, если контроли исследуемых и контрольной сыворотки в реакции будут соответствовать титру, указанному на этикетке флаконов эритроцитарного диагностикума.

Оценка реакции проводится по следующей схеме:

– 4+ — эритроциты покрывают все дно лунки равномерным слоем, иногда наблюдается зонтик;

– 3+ — эритроциты выстилают все дно лунки тонким равномерным слоем, но площадь его меньше, чем при 4-крестовой реакции, размеры зонтика также меньше;

– 2+ — агглютинат небольшой, расположен в центре лунки;

– 1+ — вокруг осадка эритроцитов в центре виден небольшой агглютинат;

– отрицательная реакция — осадок эритроцитов на дне лунки в виде пуговки или маленького кольца.

За титр сыворотки принимают ее последнее разведение с оценкой реакции не менее чем на 3+. Титр в РИГА у людей 1:50 — реакция сомнительная, 1:100 и выше — положительная.

д) Иммуноферментный анализ (ИФА) используют для диагностики всех форм заболевания, а также при эпидемиологическом обследовании населения и при отборе лиц для вакцинации против бруцеллезной инфекции.

Тест-система представляет собой набор ингредиентов для проведения ИФА на твердофазном носителе и включает в себя бруцеллезный липополисахарид либо планшет, сенсибилизированный этим антигеном, антитела против иммуноглобулинов человека, меченные пероксидазой (конъюгат), контрольные (положительная и отрицательная) сыворотки человека, набор солей, необходимый для приготовления буферных растворов, субстрат — ортофенилдиамин, твин-20, бычий сывороточный альбумин, планшеты для ИФА однократного применения. Реакцию ставят в соответствии с прилагаемой к тест-системе «Инструкцией».

Диагностическим титром на бруцеллезную инфекцию в ИФА считается разведение сыворотки более чем 1:400.

Непрямой иммунофлуоресцентный метод (нРИФ). Заранее готовят мазки из двухсуточной агаровой культуры бруцелл (1х10 9 микробных тел/мл), фиксируют их в этиловом спирте в течение 30 мин, высушивают на воздухе и помещают во влажную камеру. На одном предметном стекле делают 8 мазков. Исследуемую сыворотку разводят двукратно с разведения 1:2 до 1:320 и наносят пастеровской пипеткой на мазки, начиная с большего разведения. Влажную камеру с препаратом помещают в термостат при температуре 37°С на 30 мин.

Затем мазок отмывают от несвязавшихся антител и после подсыхания докрашивают антивидовой люминесцирующей сывороткой в рабочем разведении. Дальнейшая обработка препарата ведется как при прямой РИФ.

В качестве контролей служат препараты бруцелл, обработанные бруцеллезной сывороткой (положительный контроль) и сывороткой, не содержащей антитела к бруцеллам (отрицательный контроль).

Реакцию учитывают путем просмотра препарата под люминесцентным микроскопом. Диагностическим считается титр не менее 1:4.

Редактор: Искандер Милевски. Дата публикации: 28.1.2020

источник

Adblock
detector